植物源有機物料對果園土壤微生物群落多樣性的影響

程存剛， 趙德英， 呂德國， 姜 曼， 杜國棟

(1 沈陽農業大學園藝學院， 遼寧沈陽 110866； 2 中國農業科學院果樹研究所， 遼寧興城 125100)

土壤微生物是土壤生態系統中極其重要和最活躍的部分，是驅動土壤有機物質和養分轉化、 循環的主要動力[1]。微生物的群落多樣性在很大程度上反映了土壤有機碳庫的轉化情況[2-3]。研究表明，植物凋落物、 根系殘體、 外源有機物投入的種類和存在狀態的差異會改變土壤微生物生長所需能量物質的數量和質量，進而影響土壤微生物數量、 群落結構及活性[4]。Degens[5]已證明向土壤中添加簡單有機物可改變土壤微生物的代謝特征和代謝多樣性。

目前測定土壤微生物多樣性的方法很多，從最常規的稀釋平板法到微生物量測定、 磷脂脂肪酸分析法、 BIOLOG 微平板分析法到分子生物技術方法等。以Biolog微孔板碳源利用為基礎的定量分析為描述微生物群落功能多樣性提供了一種更為簡單、 快速的方法，已在評價不同類型土壤微生物的群落功能方面被廣泛應用[6]。

由于蘋果園大多數分布在緩坡丘陵地，土壤有機質含量低，特別是連年大量施用化肥和農藥以及一些不合理的土壤管理措施，導致土壤肥力持續下降，特別是氮、 磷嚴重流失、 土壤酸化，不僅產生了較大的環境風險，而且妨礙樹體對營養元素的吸收，降低了果實品質，嚴重地制約著蘋果產業的健康發展[7-8]。有機肥料在保持、 改善和提高土壤肥力， 活化土壤養分， 增強土壤酶活性方面有著不可替代的作用[9]。禽畜廢棄物是傳統有機肥的主要來源，但近年來動物源有機肥嚴重不足，傳統的施肥方式費時費工，同時施用禽畜廢棄物在重金屬、 鹽脅迫及病原物危害等方面存在風險[10-11]。因此如何合理利用有機肥，充分發揮其在培肥地力方面的作用，已成為生產中亟待解決的重要問題。隨著果樹有機化栽培的開展，生產者越來越重視通過施用植物源有機肥來改善果園土壤狀況，進而提高果品的產量與品質[12]。研究表明，葡萄糖、 尿素等小分子有機物以及土壤動物如蚯蚓在加快植物源有機物料在土壤中的腐解與轉化方面發揮著重要作用[13-15]。由于前人的研究主要集中在有機物料對土壤理化性狀、 微生物量、 酶活性的影響等方面[16-18]，而在有機物料對土壤微生物群落多樣性的影響，特別是有機物料腐殖化過程中驅動因子作用方面的報道較少，本試驗研究了蘋果枝條、 秸稈和雜草覆蓋后果園土壤微生物群落多樣性的差異，旨在探求葡萄糖、 尿素等小分子有機物和蚯蚓在植物源有機物料向土壤碳庫轉化中的作用，為揭示果園土壤質量的演變機制，實現果園內部的物質能量循環提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2011年4月至2012年11月在沈陽農業大學果樹試驗基地(41°83′ N，123°56′E)進行。供試土壤取自中國農業科學院果樹研究所砬山試驗基地蘋果園0—20 cm土層，采樣園面積為4.3 hm2，土壤質地為砂壤土，母質主要為花崗片麻巖風化物。采用Z形五點取樣法。試驗地為緩坡地(坡度<5°)，土壤肥力和管理水平一致。試驗前果園0—20 cm土壤有機質含量為19.9 g/kg、 堿解氮122.79 mg/kg、 速效磷6.08 mg/kg、 速效鉀219.83 mg/kg(于2011年4月30日測定)。3種植物源有機物(蘋果枝條、 玉米秸稈和果園雜草)采用FZFS665Y型移動式枝椏粉碎機粉碎，將通過1.70 mm篩的土壤和3種有機粉碎物分別以質量比為30 ∶1的比例混合均勻，作為盆栽基質。

盆栽基質中栽植生長勢整齊一致的2a生蘋果砧木山定子幼苗，栽植容器為21cm×21cm的黑色聚乙烯營養缽，每個營養缽內裝3.0 kg基質，每種基質栽植45盆。

1.2 試驗設計

盆栽試驗采用L9(34) 正交試驗設計(見表1)，于2011和2012年6月1日進行小分子有機物和蚯蚓的添加，小分子有機物均以水溶液的形式進行澆灌，以達到土壤飽和含水量為準，并以托盤放于盆底，回收外滲溶液。尿素、 葡萄糖用量為4.0 g/pot。試驗用蚯蚓為太平2號Eiseniafoetida(Savigny)成年蚓，于添加前1d對蚯蚓進行24 h的饑餓處理，選擇大小一致的蚯蚓放入盆中，按試驗設計每盆放0 條、 6條和12條，各處理重復15次。

于處理后第20 d取樣，采用破壞性取樣方法。將黑色營養缽褪掉，松動土團，提出植株，抖動植株根系，將土壤混合均勻，過0.85 mm篩，于4 ℃條件下保存，用于土壤微生物群落多樣性分析。

表1 正交試驗設計

1.3 試驗方法

土壤微生物功能多樣性采用 BIOLOG生態測試板( EcoPlatesTM，美國Matrix Technologies Corporation生產)測定。稱取相當于10 g烘干土重的新鮮土樣，加入到盛有90 mL 0.85% NaCl無菌溶液的三角瓶中，封口后在搖床上震蕩(200 r/min)30 min，按10倍稀釋法用0.85% NaCl無菌溶液將其稀釋至原來的10-3用于接種。接種量為150 μL，每樣1板，3次重復，將接種好的測試版加蓋置于25 ℃暗箱培養，連續培養192 h，期間每隔 24 h用BIOLOG讀數儀在590 nm下讀數[19]。

Biolog Eco Plate微孔板的總體顏色變化用平均孔顏色變化率(AWCD，average well color development)表示。AWCD=∑(Ci-R)/31，其中Ci為各反應孔在590 nm下的吸光值，R為對照孔的吸光值，Ci-R<0的孔在計算中記為0[20]。本研究取培養96 h時微平板光密度值進行多樣性指數計算、 主成分分析[19]。微生物群落功能多樣性的計算，包括:

豐富度(Richness)指數S，指被微生物群落利用的基質的數量。微孔的光密度值≥0.25，則認為是陽性值并計入微生物群落的豐富度 S (即此類微孔的總和)；

多樣性指數(Diversity)H H =-∑Pi×lnPi，式中， Pi= (Ci-R)/∑(Ci-R)，表示反應孔與對照孔光密度值之差和整塊板總差的比值；

均勻度(Evenness)指數 E， E =H/lnS；

優勢度(Simpson)指數Ds，Ds=1-∑Pi2，用于評估某些最常見種的優勢度。

1.4 統計分析

試驗數據采用DPS 7.05數據處理軟件進行處理，用Duncan′s 多重比較法(P<0.05)進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 培養過程中AWCD值的變化

圖1 不同處理微生物的平均顏色變化率Fig.1 AWCD of soil microbial process under different treatments

2.2 土壤微生物群落多樣性指數分析

微生物群落功能多樣性是反映其群落狀態與功能結構的指標。從表2可以看出，不同處理微生物功能多樣性不同。培養96 h后，微生物的平均顏色變化率(AWCD)和優勢度指數(Ds)以T4最大，豐富度指數(S)以T2最大，而多樣性指數(H)和均一度指數(E)各處理差異不顯著。 小分子有機物種類對S指數(F2=5.83)和DS指數(F2=5.32)的影響顯著，而有機物種類和蚯蚓數量對S指數和DS指數的影響不顯著； 有機物種類、 小分子有機物種類及蚯蚓數量均對H、E指數的影響不顯著。

表2 土壤微生物群落多樣性指數和96 h AWCD

圖2 盆栽試驗不同處理微生物對六類碳源的利用Fig.2 Utilization of 6 groups of C sources by soil microbial community of different treatments in the pot culture

2.3 微生物利用碳源情況的分析

土壤微生物對不同碳源的利用反映了微生物的代謝功能類群。根據BIOLOG-ECO板的碳源類型，將其31種碳源分為碳水化合物類、 氨基酸類、 羧酸類、 多聚物類、 芳香族類、 胺類6類，觀察不同處理微生物利用碳源的吸光值變化。

如圖2所示，各處理土壤微生物對各類碳源的利用率均有所提高。碳水化合物種類各處理間差異顯著，表現為T4>T6>T3、 T2>T1>T8>T9>T7>T5，由主體間效應檢驗看出，有機物料種類、 小分子有機物、 蚯蚓數量3個因素均對碳水化合物類碳源影響顯著，表現為F2=99.28>F3=90.04>F1=75.61； 氨基酸類的AWCD值表現為T4>T6、 T7、 T3>T5、 T2>T8、 T1>T9，3個因素均對氨基酸類AWCD值的影響顯著，且以蚯蚓數量與有機物料種類影響較為顯著，表現為F3=128.65>F1=111.43>F2=20.19； 羧酸類AWCD值表現為T5>T4>T3>T7、 T2>T8>T6、 T9>T1，表明3個因素均對羧酸類AWCD值的影響顯著，且以小分子有機物種類的影響最為顯著，表現為F2=1786.13>F1=1028.95>F3=722.96； 多聚物類的AWCD值表現為T4、 T1、 T2>T3>T6>T8、 T9>T7>T5，顯示3個因素均對多聚物類AWCD值的有顯著影響，且有機物料種類的影響最顯著，表現為F1=1370.78>F2=1035.46>F3=574.86； 芳香族類AWCD的值表現為T3>T8>T6>T9>T1>T7、 T5>T4、 T2，說明3個因素均對芳香類AWCD值的影響顯著，表現為F2=86.40>F1=28.35>F3=23.01； 胺類AWCD值表現為T1>T2、 T4>T7>T9、 T3>T8>T5>T6，3個因素均對胺類AWCD值也有顯著影響，且以有機物料種類影響最為顯著，表現為F1=324.36>F2=170.08>F3=8.57。

2.4 微生物群落主成分分析

土壤微生物多樣性反映了群落總體的變化，但未能反映微生物群落代謝的詳細信息，研究土壤微生物對不同碳源利用能力的差異，有助于更全面地了解微生物群落代謝功能特性[22]。從表3可以看出，以培養96 h時不同處理微生物對微孔板上31種碳源利用情況做PCA分析，31個成分因子中前5個的累計方差貢獻率達到84.03%，從中提取可以聚集單一碳源變量的數據變異的前2個主成分PC1和PC2(它們的累計方差貢獻率為48.37%，特征根分別為10.11和4.88)來分析土壤微生物功能多樣性。

表3 主成分的特征根

圖3 不同處理微生物群落碳源利用主成分分析Fig.3 PCA of carbon utilization of the soil microbial community

圖3顯示，不同處理對微生物利用碳源的分異情況差異顯著。第1主成分(PC1)聚集了42.15%的數據變異，第2主成分(PC2)聚集了 16.15%的數據變異，兩主成分基本能夠反映土壤微生物群落碳源利用情況的主要信息。PC1軸T2、 T4主要分布在正方向，T5、 T7、 T8主要分布在負方向，表明小分子有機物葡萄糖、 尿素以及蚯蚓數量是影響土壤微生物對碳源利用能力差異的主要因素。

由表4可以看出，對PC1貢獻大(特征向量≥0.20)的碳源有12種，碳水化合物類占6種，多聚物類和胺類各占2種，氨基酸類和羧酸類各占1種。對PC2貢獻大的碳源有11種，碳水化合物類占4種，多聚物類和芳香類各占2種，氨基酸類、 羧酸類和胺類各占1種。從中可以看出，對PC1和PC2起分異作用的主要碳源分別是碳水化合物類和多聚物類。

3 討論與結論

微生物利用有機物質作為能源，其生命活動可以加速有機物的分解和營養元素在土壤生態系統中的循環[23]。有機物料作為外源有機碳源輸入土壤中，會對土壤有機碳庫的轉化產生影響。前人曾利用不同的有機物料在不同的土壤和生態體系中，對植物殘體的分解、養分的釋放以及土壤生物的作用等方面作過不少的研究[24-25]。

表4 對PC1和PC2貢獻的特征向量絕對值≥0.20的碳源

作為外源有機物的農業生產廢棄物的枝條、 秸稈和雜草進入土壤后都是較難分解的有機物，不利于微生物快速繁殖利用。有機物的組分不同，分解難易就不同，其腐殖化產物的質量和性質也不同[26-27]。李云樂等[28]研究發現，在有機物分解初期，土壤微生物能比較快地遷移到秸稈表面，秸稈表面的生物數量最多的是細菌，隨著細菌的數量增加，有機物分解速度加快。而有機物分解后期，細菌的數量逐漸減少，有機物的分解速度逐漸減慢[29]。本研究結果表明，有機物料的種類對于微生物種群結構的影響差異顯著，表現為在枝條處理中微生物的功能多樣性較強，雜草較枝條更易分解，秸稈處于枝條和雜草處理之間，但由于秸稈的含氮量相對更高，微生物的功能多樣性相對較強，等質量的枝條、 秸稈和雜草處理后，枝條處理的微生物多樣性增加最顯著。

葡萄糖、 尿素作為微生物的碳源和氮源物質，進入土壤后迅速為微生物所利用，增加了微生物數量，快速增長的微生物群落，促進了外源有機物料碳向土壤碳庫的轉化，微生物的功能多樣性也顯著增強[13-14,30]。于躍躍和趙炳梓[31]的研究表明，添加葡萄糖可顯著提升土壤微生物活性，其中在纖維素存在的基礎上以無機氮與葡萄糖共同添加的提升效果最為顯著。本試驗中，加入葡萄糖小分子有機物，可為土壤微生物提供可迅速利用的碳源，微生物大量繁殖，加快了添加的外源枝條、 秸稈和雜草分解的速度； 而尿素的加入，為微生物的生長提供了氮源，但單獨添加尿素對微生物的功能活性影響不大。

蚯蚓作為陸地生態系統中重要的大型土壤動物，能明顯促使植物殘體進入土壤，加快植物殘體在土壤中的分解與轉化[15]。土壤中接種蚯蚓對土壤微生物群落組成及活性產生深刻影響[32]。土壤微生物群落特性變化受蚯蚓作用和土壤類型及植物殘體間交互作用的影響[33-34]。本試驗研究表明，蚯蚓活動對微生物功能多樣性的影響較葡萄糖的影響效果小，但蚯蚓取食有機物料，分泌各種水解酶，通過有機質的再分布與加工過程直接或間接影響微生物的組成、 豐富度和活性，并通過蚯蚓糞內微生物的富集并釋放到土壤中而增加特定類群土壤微生物數量，突出了優勢作用微生物在土壤中的分配。

微生物功能多樣性能夠反映土壤質量指標信息，可看作是評價土壤質量變化的敏感參數。植物源有機物及外源驅動因子的加入，一方面由于土壤環境的改變，本身會影響微生物的群落結構和功能，另一方面使土壤中養分的轉化發生了明顯的改變，從而影響微生物的代謝活性。BIOLOG 測試系統是快速測定土壤微生物群落功能代謝多樣性的一種潛在有效手段，但由于果園土壤微生物具有獨特的生理類型，使得果園土壤具有獨特的微生物多樣性，因此，在應用BIOLOG 測試系統鑒定微生物群落的潛在功能多樣性時, 應進一步研究產生其代謝的土壤剖面差異的微生物種類，將碳源利用速率與根際環境中實際存在的碳源有效性聯系起來，以完善該技術在果園土壤環境研究中的應用。

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