磷轉運蛋白基因TaPht1;4的染色體定位及其在低磷下與小麥吸磷能力的關系

郭 麗, 郭程瑾, 路文靜, 李小娟, 肖 凱*

(1 河北農業大學農學院， 河北保定 071001； 2 河北農業大學生命科學學院，河北保定 071001)

磷易被吸附、 固定的特性導致作物對磷素資源的利用效率較低[1]。磷素作為不可再生資源，世界范圍內用于生產磷肥的磷礦石資源日益枯竭[2]。利用植物在吸收和利用磷素資源上表現的遺傳多樣性特征，提高作物抵御低磷逆境能力，對于促進磷素資源的可持續利用具有重要實踐意義。

研究表明，作物根系存在兩個磷素吸收運載系統，其中一個系統對介質中磷素具有高親和特性(Km值變化在3至7 μmol/L)，主要參與對低濃度無機磷(Pi)供應水平下介質中的磷素吸收[1]； 另一個系統對介質中磷素具有低親和特性(Km變化在50至330 μmol/L)，主要參與高濃度Pi供應水平下介質中的磷素吸收以及植株中Pi在細胞、 組織間的轉運[2-3]。研究證實，位于根系表皮和根毛細胞質膜上的高親和磷轉運蛋白(PT)和位于植株中各器官、 組織細胞質膜的PT，分別是上述高、 低親和磷素吸收運載系統的重要組分[1,3 ]。迄今，在擬南芥和水稻等不同植物種屬中已鑒定了許多PT基因，并對上述基因分子特征及介導磷素吸收和轉運的生物學功能及其機理進行了深入研究[4-8]。

小麥是我國重要糧食作物，提高小麥的磷素利用效率對于保障我國糧食安全和促進農業可持續發展具有重要現實意義。迄今，盡管有關小麥磷素吸收、 利用的遺傳學差異、 生理生化機制和小麥基因型(品種)的磷效率鑒定評價指標已開展較多研究[9-11]，但有關小麥PT基因的鑒定、 分子特征分析和功能解析研究與擬南芥和水稻相比仍較少。前期工作中，作者對1個歸屬于高親和家族的小麥PT基因TaPht1; 4進行了克隆和功能分析，發現該基因在介導植株低磷逆境下的磷素吸收中發揮著重要作用[8]。本研究以中國春遺傳背景的整套B染色體雙端體為材料，對TaPht1; 4的染色體定位特征以及該小麥磷轉運蛋白基因與低磷下不同磷利用效率小麥品種磷效率的聯系進行了研究，旨在為今后小麥品種及資源的磷效率分子鑒定和耐低磷小麥磷高效遺傳改良提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.2 TaPht1; 4在染色體上定位鑒定分析

參照郭程瑾等(2011)的方法[12]，水培CS及整套B染色體組雙端體材料。三葉期時，收獲各供試材料根系。采用基因組DNA提取試劑盒(TaKaRa)提取各材料基因組DNA。以各材料基因組DNA為模板，采用TaPht1; 4特異引物，進行目標基因擴增。擴增TaPht1; 4的引物為5′-TTCACGACCTGGCCTGC (正向)和5′-TTACAAAATTTCCACGCTGT(反向)[8]。PCR擴增條件為95℃ 4 min，隨后進行28個下述循環: 95℃ 1 min，55℃ 40 s，72℃ 1 min。通過對PCR擴增產物進行電泳檢測，進一步對擴增產物克隆和測序鑒定，闡明TaPht1; 4在染色體上的定位。

1.3 供試材料TaPht1; 4的表達分析

參照上述培養方法[12]，水培CS、 整套B染色體組雙端體和不同磷素吸收效率品種至三葉期。然后轉入低磷脅迫(20 μmol/L Pi)進行48 h處理。期間，在處理后24 h收獲根葉樣本，以低磷處理前的根、 葉作對照。采用Liu等(2013)的方法[8]，進行樣本總RNA提取、 RNA反轉錄和TaPht1; 4的半定量RT-PCR及實時定量PCR(qPCR)分析。 其中，以在小麥中呈組成型表達的微管蛋白基因(tubulin)作為上述各樣本分析中TaPht1; 4轉錄本均一化內標。擴增tubulin的正向引物為5′-CATGCTATCCCTCGTCTCGACCT， 正向引物為5′-CGCACTTCATGATGGAGTTGTAT。

1.4 供試材料的單株干物重和磷吸收參數分析

選擇各供試材料均勻的種子，萌發后分別轉入正常供磷(MS營養液，1.2 mmol/L Pi)和低磷脅迫(調整含磷后的MS， 50 μmol/L Pi)2種處理下水培，具體參照郭程瑾等的方法[12]進行。處理3周后，選取代表性幼苗，參照Guo等的方法[13]進行單株干重和全磷含量測定。以單株干重和全磷含量的乘積計算出單株磷累積量，通過單株干重除以單株磷累積量求得磷效率。

1.5 統計學分析

本研究中PCR擴增、 半定量RT-PCR和1PCR分析以及植株干重和磷吸收參數測定均進行3次重復。采用SAS統計學分析軟件，對豐、 缺磷條件下供試材料的單株干重、 磷效率參數和qPCR中基因表達水平進行平均值計算、 標準差分析和統計學上的顯著性測定分析。

2 結果與分析

2.1 磷轉運蛋白基因TaPht1; 4在染色體臂上的定位

以中國春(CS)和分別缺少該品種B染色體組各長、 短臂的整套雙端體為材料，采用PCR技術，對高親和磷轉運蛋白基因TaPht1; 4的染色體定位特征進行了研究。結果表明，與CS及其他雙端體材料能特異擴增目標基因的結果不同，在3BS中未擴增到目標基因(圖1A)。采用半定量RT-PCR和qPCR對豐、 缺磷條件下CS和各雙端體根、 葉中TaPht1; 4的表達進行了檢測。結果顯示，豐磷條件下，各供試材料根、 葉片中均檢測不到TaPht1; 4的表達(資料未列出)； 缺磷條件下，各供試材料葉片中也均未檢測到TaPht1; 4的表達，但在根系中除3BS未檢測到TaPht1; 4表達外，CS和其他雙端體均具有較高的TaPht1; 4表達水平(圖1B，圖1C)。因此說明，TaPht1; 4定位在3B染色體長臂，呈低磷誘導和根系特異表達特征，該表達特征與先前的研究結果[8]一致。

圖1 TaPht1; 4在CS及其B染色體組雙端體的PCR擴增和表達水平檢測Fig.1 PCR amplification and expression level of TaPht1; 4 in CS and its ditelosimic lines of B chromosome

2.2 豐、 缺磷條件下喪失TaPht1; 4基因3BS和中國春的干物質積累特征

豐磷條件下，3BS單株干重與CS沒有差異； 缺磷條件下，與CS相比，3BS單株干重顯著降低(圖2)。表明缺少TaPht1; 4及所在3B染色體長臂后，植株的干物質生產能力受到較大影響，這可能與由于缺乏該染色體臂喪失TaPht1; 4造成低磷逆境下植株的磷素吸收能力降低具有緊密聯系。喪失TaPht1; 4對豐磷條件下的植株干物質生產沒有明顯影響，可能是由于該小麥PT基因不參與豐磷條件下植株磷素吸收或該條件下植株磷素吸收是由于其他PT成員介導所致。

圖2 豐、 缺磷條件下CS和3BS的單株干重Fig.2 The plant dry weight of CS and 3BS under conditions of Pi sufficience and Pi deprivation

2.3 豐、 缺磷條件下喪失TaPht1; 4基因3BS和中國春的全磷含量、 磷累積量和磷效率

與CS相比，豐、 缺磷條件下3BS植株全磷含量以及磷效率均無明顯改變(圖3)。豐、 缺磷條件下3BS的單株磷累積量與CS相比其表現規律與單株干重相同，表現為豐磷條件下兩者無明顯差異，但低磷條件下3BS的單株磷累積量較CS顯著減少(圖3)，表明缺少3B染色體長臂及相應TaPht1; 4后，與CS相比3BS在豐、 缺磷條件下的植株含磷量和磷效率沒有變化，但低磷脅迫條件下的植株磷素吸收數量減少。低磷脅迫條件下3BS植株磷吸收量減少可能是其單株干重較CS顯著降低的重要原因。

2.4 不同磷效率小麥品種TaPht1; 4的表達特征、 單株干重和磷效率參數特征

以6個低磷下不同磷吸收效率的小麥品種為材料，對豐、 缺磷條件下各小麥品種TaPht1; 4的表達水平以及單株干重、 全磷含量、 磷累積量和磷效率進行了研究。結果表明，豐磷條件下，不同品種根、 葉中均檢測不到TaPht1; 4的表達(資料未列出)，各品種間的單株干重、 全磷含量、 磷累積量和磷效率也無明顯差異(圖4)； 缺磷條件下，不同小麥品種根系中的全磷含量和磷效率也無明顯差異，但根系中TaPht1; 4表達水平、 單株干重和單株磷累積量呈現明顯的變化規律，表現為隨著品種磷吸收效率的提高，TaPht1; 4表達水平隨之增高(圖5)、 單株干重和單株磷累積量也隨之增大(圖4)。上述結果表明，低磷脅迫條件下TaPht1; 4的表達水平與小麥品種在低磷逆境下的磷素吸收和干物質積累具有緊密聯系。

圖3 豐、 缺磷條件下CS和3BS的全磷含量、 單株磷累積量和磷效率Fig.3 Total P content, plant dry weight and P use efficiency of CS and 3BS under Pi sufficiency and Pi deprivation

圖4 豐、 缺磷條件下不同磷吸收效率小麥品種的單株干重、 全磷含量、 磷累積量和磷效率Fig.4 The plant dry weight, total P content, accumulative P amount and P use efficiency in wheat cultivars with different low-P use efficiencies under P sufficiency and P deprivation

圖5 缺磷條件下不同磷吸收效率小麥品種根系中TaPht1; 4的表達水平Fig.5 The expression levels of TaPht1; 4in the roots of wheat cultivars with different low-P use efficiencies under P deprivation

3 討論與結論

磷轉運蛋白(PT)在介導植株吸收和轉運磷素的過程中發揮重要作用。研究表明，植物根系對生長介質中磷素的吸收以及已吸收至植株體內磷素在組織和細胞間轉運，是由位于細胞質膜上的PT介導完成的。期間由H+-ATPase提供驅動H+與Pi共轉運的動力[1,14]。基因功能分析發現，部分特定植物種屬PT成員，在增強低磷逆境下植株的磷素吸收能力中發揮著重要功能[8,15-18]。

高親和PT基因具有很強的親和Pi能力，在表達上多呈根系特異/優勢表達且受到外界低磷逆境誘導的特征[1-2,19-22]。上述表達特征及親和Pi的生化特性，是該類別PT成員構成低磷脅迫條件下根系吸收介質中磷素主體的重要分子基礎。作者的前期研究表明，TaPht1; 4是歸屬于PHT1家族的小麥高親和PT成員，具有補償缺失磷素吸收酵母突變體的磷素吸收能力，在增強植株抵御低磷逆境中發揮著重要功能[8]。本研究采用分別僅缺失B染色體組各長、 短臂的整套雙端體為材料，利用PCR和基因表達檢測技術對TaPht1; 4在染色體上的定位進行了鑒定。表明該小麥高親和PT基因定位在3B染色體的長臂上。缺失該染色體臂的雙端體3BS，低磷脅迫條件下植株的干物質生產能力和單株磷累積量與對照中國春(CS)以及其他B染色體組雙端體相比明顯下降。表明位于3B染色體長臂的TaPht1; 4，通過對低磷逆境特異應答及表達蛋白對介質中Pi高度親和，在較大程度上調控低磷條件下植株的磷素吸收能力，進一步對低磷逆境下植株的干物質生產能力產生重要影響。

植株對豐、 缺磷條件下介質中磷素的吸收，是由高、 低磷吸收運載系統分別介導完成的[1,3]。其中，高、 低親和PT成員分別是上述磷素吸收運載系統的重要組分[1-3]。本研究發現，在豐磷條件下，與中國春(CS)相比，3BS以及其他B染色體組雙端體的單株干重、 全磷含量、 單株磷累積量和磷效率沒有差異。表明該供磷水平下植株的磷素吸收能力和干物質生產能力與3B染色體長臂的缺失以及TaPht1; 4的存在與否無關。這與TaPht1; 4是高親和運載系統組分， 該系統主要參與低磷逆境下植株的磷素吸收，而在豐磷條件下植株對介質的磷素吸收由其他低親和PT成員介導有關。有關參與豐磷條件下小麥磷素吸收的低親和PT基因及其調控植株吸收和轉運磷素的分子機理有待進一步探討。

小麥不同基因型(品種)在磷素吸收和利用能力上存在明顯的遺傳學差異[9]。闡明小麥抵御低磷逆境能力的分子標記對于耐低磷小麥遺傳學材料鑒定、 磷高效小麥育種后代材料篩選以及小麥品種(品系)的磷效率評價具有重要指導意義[8, 10-11]。本研究對低磷脅迫條件下不同低磷吸收效率的小麥品種中TaPht1; 4表達水平、 干物質生產特征和磷素吸收能力的研究表明，不同磷吸收效率小麥品種低磷逆境下的單株干重和單株磷累積量與TaPht1; 4的表達水平密切相關。因此，TaPht1; 4可作為低磷脅迫下小麥磷素吸收和干物質生成能力的分子評價指標。

綜上，本研究表明， 小麥高親和PT基因TaPht1; 4定位在3B長臂。豐磷條件下，與CS相比，3BS的單株干重、 全磷含量、 磷累積量和磷效率沒有改變； 低磷條件下，3BS的單株干重和磷累積量較CS顯著降低。豐、 缺磷條件下，不同磷吸收效率小麥品種TaPht1; 4的表達水平與植株干重和單株磷累積量密切相關。TaPht1; 4能顯著增強小麥在低磷逆境下的磷素吸收能力，可作為小麥品種耐低磷能力的分子評價參考指標。

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