根際pH對玉米利用磷酸單酯和雙酯鹽的影響

王 悅, 符 力, 馮 固

(中國農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院， 北京 100193)

磷酸酶的活性受土壤pH、 底物濃度等因素的影響[2]。根據(jù)磷酸單酯酶最大活性時所在的pH范圍將磷酸酶分為酸性磷酸酶和堿性磷酸酶，最適pH值高于7.0的稱為堿性磷酸酶，低于7.0稱為酸性磷酸酶[5-6]。植物根系和土壤細菌能夠分泌酸性磷酸酶[7-8]，pH 值高于 7.0 時酸性磷酸酶活性迅速降低[5]。相對于酸性磷酸酶，堿性磷酸酶由細菌產(chǎn)生，底物專一性強[9]。此外，植物對土壤中有機磷的利用除了受磷酸酶活性影響之外，另一個重要影響因素是磷酸酶底物有效性的大小[10]，而根際pH不僅影響磷酸酶活性，而且還顯著影響底物的有效性[11]。以往關于磷酸單酯酶的研究報道已經(jīng)較多，而根際pH變化對磷酸雙酯鹽和磷酸單酯鹽礦化過程的影響有何區(qū)別未見報道。

本文研究目的在于了解作物利用磷酸單酯鹽或磷酸雙酯鹽的過程是否受到根際pH變化的調節(jié)。本試驗采用瓊脂無菌培養(yǎng)體系，通過向玉米植株供應不同氮源(硝態(tài)氮、 銨態(tài)氮)和磷源(植酸鈣、 卵磷脂)，分析了玉米根際磷酸單酯酶和磷酸雙酯酶的活性對根際pH的響應及相應磷酸鹽的利用，以期為理解玉米根際磷營養(yǎng)的調控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試植物

供試植物為玉米磷高效基因型181(ZeamaysL.181)。挑選飽滿、 大小一致、 重量相差小于0.1 g的玉米種子，在超凈臺內(nèi)用70%的乙醇浸泡10 min，然后用15%的H2O2浸泡20 min，用無菌水沖洗3次，最后在無菌水中浸泡2 h。滅菌完成后，將種子放在裝有MSR培養(yǎng)基直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中，每皿四粒種子，蓋上培養(yǎng)皿蓋，用石蠟膜封口，置于黑暗中在27℃培養(yǎng)箱中萌發(fā)。5 d后，挑選根系形態(tài)相似，大小一致的無菌玉米幼苗，去胚乳，轉移至無菌試驗裝置中，用石蠟膜封口后放在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光周期為12 h，光照強度為500 μmol/(m2·s)。

1.2 培養(yǎng)基質

1.3 試驗設計

試驗采用無菌培養(yǎng)裝置，以直徑150 mm，高14 mm的培養(yǎng)皿為底座，培養(yǎng)皿蓋上打孔(與瓶口大小一致)，上方粘結300 mL無色透明的塑料瓶，滿足植株地上部生長空間，整個裝置密封后經(jīng)輻照滅菌，滅菌后在超凈工作臺完成倒培養(yǎng)基、 移苗等步驟。在瓶的頂部打幾個小孔，貼上空氣過濾膜(圖1)。

圖1 無菌培養(yǎng)皿試驗裝置示意圖 Fig.1 Diagram of the Petri dish system used in the experiment

培養(yǎng)21 d后收獲。收獲時，小心地將帶有塑料瓶的培養(yǎng)皿蓋打開，用干凈的鑷子或解剖刀沿著玉米根系將覆蓋于根表的瓊脂剝離開來，注意不能損傷根系，將根完整地取出，根系用滅菌的去離子水沖洗干凈，放入裝有10 mL無菌去離子水的離心管中，溶液要將根系完全浸沒，將整個植株放在正常光照下30 min，收集根分泌物。30 min后，將植株取出，用吸水紙沾干，在相同的部位剪下地上部，稱取地上部鮮重，放入信封、 編號，在105℃下殺青30 min，70℃下烘干至恒重，然后稱取干重。

1.4 測定項目與方法

1)根際pH的測定: 將根從瓊脂中小心取出后，沿根痕跡橫向1 cm內(nèi)取瓊脂至5 mL離心管中，將瓊脂充分打碎，用精密pH儀(UB-7, Denver Instument, Dever, USA)測定pH值。

2)根際磷酸酶活性測定: 根際磷酸單酯酶活性用改進的Tabatabai 和Brimner[12]的方法測定； 根際磷酸雙酯酶活性參考Richardson等[13]的方法測定。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)均采用Excel進行計算，采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件進行雙因素方差分析(two-way AVOVA)，5%水平最小顯著差異法(LSD)進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 供氮形態(tài)及有機磷形態(tài)對玉米生物量及氮、 磷吸收的影響

供氮形態(tài)顯著影響玉米的生長。在相同的有機磷酸鹽條件下，供應硝態(tài)氮處理的玉米地上部干重均顯著高于銨態(tài)氮處理。根系干重在卵磷脂為磷源條件下也表現(xiàn)為硝態(tài)氮處理顯著高于銨態(tài)氮處理。不同有機磷酸鹽對玉米生長也存在顯著影響。在供應銨態(tài)氮時，卵磷脂與植酸鈣處理的地上部和根系生物量均沒有顯著差別。但是供應硝態(tài)氮時，地上部和根系生物量均表現(xiàn)為卵磷脂處理的顯著高于植酸鈣處理(表1)。

供應植酸鈣時，銨態(tài)氮處理的玉米植株來自有機磷酸鹽的磷量顯著高于硝態(tài)氮處理。不同有機磷酸鹽對植株來自有機磷酸鹽的磷量也有顯著影響，在供應銨態(tài)氮條件下，植酸鈣處理的植株來自有機磷酸鹽的磷量顯著高于卵磷脂處理； 供應硝態(tài)氮時，卵磷脂處理顯著高于植酸鈣處理(表1)。

供氮形態(tài)顯著影響玉米的地上部氮含量，而對玉米根系的氮含量無顯著影響。在相同有機磷酸鹽條件下，硝態(tài)氮處理的地上部氮含量均顯著高于銨態(tài)氮處理(圖2A)。不同有機磷酸鹽對玉米地上部和根系氮含量也有顯著影響，在供應銨態(tài)氮時，植酸鈣處理的地上部氮含量顯著高于卵磷脂處理(圖2A)，而根系氮含量，無論是供應銨態(tài)氮還是硝態(tài)氮，卵磷脂處理的均顯著高于植酸鈣處理(圖2B)。

表1 供應不同氮素形態(tài)條件下玉米地上部干重、 根干重和來自有機磷酸鹽的磷量

圖2 供應不同氮素形態(tài)條件下玉米地上部氮含量(A)、 根氮含量(B) Fig.2 N content in the shoots (A), N content in the roots (B) of maize in response to different nitrogen forms

2.2 不同供氮形態(tài)、 有機磷形態(tài)對玉米根際pH和根際磷酸酶活性的影響

由表2可以看出，玉米根際供應不同形態(tài)氮素能顯著改變根際pH值。相同有機磷處理下不同氮素形態(tài)處理間比較，無論以植酸鈣還是卵磷脂為有機磷源，玉米根系吸收銨態(tài)氮后，根際pH都顯著降低，至收獲時，達到4.0左右，而硝態(tài)氮作為氮源，根際pH值上升至 6.6左右。相同供氮處理條件下，不同有機磷酸鹽處理間比較，無論根際供應銨態(tài)氮還是硝態(tài)氮，植酸鈣與卵磷脂處理的根際pH值之間均沒有顯著差異。

表2 供應不同氮素形態(tài)條件下玉米根際pH, 根際磷酸單酯酶活性和磷酸雙酯酶活性

供氮形態(tài)顯著影響玉米根際磷酸單酯酶和磷酸雙酯酶的活性(表2)。在相同有機磷酸鹽處理條件下，供應硝態(tài)氮處理的根際磷酸單酯酶活性均顯著高于銨態(tài)氮處理。對于根際磷酸雙酯酶而言，以卵磷脂為磷源條件下也表現(xiàn)為硝態(tài)氮處理顯著高于銨態(tài)氮處理。不同有機磷酸鹽對玉米根際磷酸單酯酶和磷酸雙酯酶活性也存在顯著影響，無論是供應硝態(tài)氮還是銨態(tài)氮，以卵磷脂為磷源條件下的根際磷酸單酯酶活性均顯著高于植酸鈣處理。根際磷酸雙酯酶活性也表現(xiàn)為根際供應硝態(tài)氮時卵磷脂處理顯著高于植酸鈣處理。

3 討論

圖3 玉米根分泌的磷酸單酯酶、 磷酸雙酯酶活性對pH的響應 Fig.3 The response of phosphomonoseterase and phosphodiesterase activities to pH

不同類型的磷酸酶對有機磷酸鹽具有底物專一性，磷酸雙酯需要先通過磷酸雙酯酶水解磷酸雙酯鍵，其產(chǎn)物在磷酸單酯酶作用下進一步水解成正磷酸根[4]。以往的研究通常只檢測磷酸單酯酶活性，并依據(jù)緩沖液的pH將這類磷酸酶分為酸性或堿性磷酸酶，這樣不考慮底物測定的結果不能完整地解釋不同形態(tài)有機磷的礦化過程。本研究證實，玉米根系分泌的磷酸單酯酶和磷酸雙酯酶最適pH略有不同，并且以卵磷脂為有機磷源時，兩種酶活性與玉米吸收相應的有機磷酸鹽的量呈顯著正相關性(圖4)，說明玉米根系分泌的磷酸酶對有機磷的活化利用發(fā)揮了直接的作用。

圖4 玉米植株來自有機磷酸鹽的磷量與根際磷酸單酯酶(A)和磷酸雙酯酶(B)活性的關系 Fig.4 The correlation between P from organic phosphates and rhizosphere phosphomonoseterase (A) and phosphodiesterase (B) activitie

有機磷的水解過程由磷酸酶活性和有機磷底物有效性兩個因素控制[10]。首先，酶活性與環(huán)境pH密切相關。本試驗證明供應銨態(tài)氮或硝態(tài)氮改變了玉米根際pH，導致根際磷酸單酯酶和磷酸雙酯酶的活性發(fā)生了變化(表2)。供銨態(tài)氮時，pH值降低到4.0，酶活性偏離其適宜pH值較遠。而供應硝態(tài)氮時，根際pH在最適范圍附近，磷酸酶活性較高(表2和圖3)。然而，在供應銨態(tài)氮時，玉米對植酸鈣的利用大于硝態(tài)氮處理，盡管供銨態(tài)氮時磷酸酶活性并不比供硝態(tài)氮時更高。

植酸鈣是難溶性的有機磷酸鹽，它不能直接與磷酸酶結合，即使在根際中存在較高的磷酸單酯酶活性的條件下，玉米對其活化利用效率也不高。供應銨態(tài)氮時，pH值降至4.0，這比供應硝態(tài)氮時 (pH值達6.6) 更有利于植酸鈣的溶解，增加了植酸根對于磷酸單酯酶的有效性，促進更多的植酸態(tài)磷的礦化，使玉米獲得了比供硝態(tài)氮時更多的磷。因而，在供應銨態(tài)氮時，植酸鈣溶解度較高而兩種磷酸酶活性較低，植酸鈣處理中玉米吸收的磷量要高于卵磷脂處理。相反，在供應硝態(tài)氮的條件下，植酸鈣溶解度較低而兩種磷酸酶活性較高，與植酸鈣處理相比，此時卵磷脂處理的植株吸收了較多的磷(表1)。這一結果說明pH 4.0(供銨態(tài)氮)比pH 6.6(供硝態(tài)氮)更有利于植酸鈣的溶解，使植酸根對磷酸單酯酶底物有效性更高，從而有利于植酸磷的礦化。卵磷脂不與金屬離子結合，pH對其底物有效性的影響不大，其礦化量主要受磷酸酶活性的制約，pH對磷酸雙酯酶活性的調節(jié)直接影響卵磷脂的活化利用。以植酸鈣為有機磷源時玉米植株來自磷酸鹽的磷量與根際磷酸單酯酶活性的相關性不顯著，而以卵磷脂為有機磷源時玉米地上部磷含量與根際磷酸單酯酶活性(R2=0.7526,P=0.0252)或磷酸雙酯酶活性(R2=0.9372,P=0.0015)均有顯著的線性正相關關系，這也間接說明了底物有效性對于有機磷活化利用的作用大于磷酸酶活性。

綜上所述，土壤中大多數(shù)有機磷被土壤膠體顆粒吸附或與金屬離子結合形成沉淀[17-18]。本研究結果表明，土壤有機磷的活化必須首先轉化為能溶解于溶液中的形態(tài)，底物與磷酸酶能更好地結合并水解。我國長期施用化肥導致北方土壤大范圍酸化[19]，本試驗結果說明這種酸化對土壤固有或隨有機物料進入農(nóng)田的有機磷的活化無疑是具有重要貢獻的，在北方土壤養(yǎng)分管理中應加以考慮。

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