Fe2+對水稻生長及土壤微生物活性的影響

陳 娜， 廖 敏*， 張 楠， 徐培智， 解開治， 徐昌旭， 劉光榮

(1 浙江大學環境與資源學院，杭州 310058; 2 浙江省亞熱帶土壤與植物營養重點研究實驗室，杭州 310058; 3 廣東省農業科學院土壤肥料研究所，廣州 510640; 4 江西省農業科學院土壤肥料與資源環境研究所，南昌 330200)

冷浸田是長期浸水的強潛育性低產水稻田，又稱冷浸性水稻土，土壤中以Fe2+為主的還原性物質大量積累并對水稻生長產生毒害作用。冷浸田主要分布在我國南方各省山地、 丘陵和沖積平原的低洼地，全國約有346萬公頃，占全國稻田面積的15.07%，占低產稻田面積的44.2%，是我國低產水稻土的一個主要類型[4]。目前，關于鉛、 鎘等重金屬對水稻的毒害效應及臨界值已有不少的研究[5，6]，但對我國有關冷浸田還原態鐵致毒劑量臨界值及其機理的研究卻鮮有報道，且相關研究主要集中在以營養液培養試驗來探討過量Fe2+對水稻的毒害效應及其機理[7]。其缺點是水培試驗條件與大田相差懸殊，無法模擬土壤中的復雜環境狀況，從而難以將研究者的試驗結果廣泛應用于實際農業生產，嚴重影響了冷侵田土壤毒害和養分供應障礙的調控，制約了冷侵田土壤生產力提升。

鑒此，本研究以廣泛應用的雜交組合杭43為材料，以土培試驗模擬冷浸田土壤環境，研究了不同外源Fe2+質量濃度處理下微生物生物量活性及其生態特征、 水稻的生理生長及抗氧化酶系統活性等土壤-水稻生態系統的動態變化[8]，探討水稻鐵毒脅迫的生態毒理性，以期為冷浸田土壤鐵毒劑量臨界值及其機理等的研究提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 土壤采集與水稻栽培

供試土壤為采自浙江大學紫金港試驗場的水稻土。取表層0—20 cm土層的土樣， 土樣自然風干后過3.2 mm篩備用, 供試土壤的基本理化性質見表1。分別稱取相當于4.0 kg烘干土質量的風干土樣置于80 cm2×20 cm(底面積×高)塑料盆缽中，外源添加硫酸亞鐵。設計亞鐵處理水平為0、 100、 200、 400、 800和1600 mg/kg土壤 (純亞鐵計), 重復3次。同時分別拌入0.4 g/kg尿素、 0.4 g/kg磷酸氫二鉀做基肥，混勻，淹水培養5 d后移栽具有25 d苗齡的水稻秧苗，每盆定苗4株。試驗過程中模擬冷浸田土壤低溫浸水的還原態環境，在盆口覆保鮮膜以減少外界空氣對內部土壤還原環境的氧化，盆底安裝循環去熱通水水槽以降低盆內土壤溫度，整個生育期保證每天定時澆水補充盆內水分損失并始終保持2 cm水層以隔絕外部空氣，常規管理。為避免自然水體中養分離子對后期試驗的影響，本試驗特選定符合GB17324—2003《瓶(桶)裝飲用純凈水衛生標準》的純凈水為唯一供試用水，供試水稻品種為常規晚粳稻杭43，試驗在浙江大學紫金港校區網室進行。

1.2 樣品采集

土壤樣品于淹水預培養5 d后，在移栽水稻秧苗的15 d(苗期)、 30 d(分蘗期)采集。用特制的注射取樣器(將醫用50 mL注射器前端針孔與針管連接處平切成帶活塞芯桿的圓柱管狀采樣器，利用芯桿拔出產生的氣壓采集土壤)，多次、 多點抽取0—10 cm的表層土壤樣品，集中于封口袋中，用玻璃棒拌均，制成混合土樣，測定新鮮土壤微生物數量、 微生物量碳及亞鐵含量。

在水稻分蘗期階段測定水稻株高及成活率，使用便攜式葉綠素儀測定水稻倒三葉葉片SPAD值，采集水稻倒三葉放入墊有紗布的托盤中，冰浴冷凍處理，帶回室內分析過氧化物酶(POD)、 超氧化物歧化酶(SOD)、 過氧化氫酶(CAT)活性及脯氨酸(proline)含量。

1.3 測定方法

土樣的基本理化性質采用常規分析方法。土壤亞鐵用0.1 mol/L硫酸鋁浸提，分光光度法測定; 土壤微生物量碳用氯仿熏蒸—0.5 mol/L K2SO4提取，TOC-500自動分析儀測定[9]; 同類型的微生物數量采用稀釋平板計數法測定; 葉綠素含量(SPAD值)—葉綠素儀非破壞性快速測定[10]; 脯氨酸含量—磺基水楊酸提取，茚三酮比色法測定[11]; 過氧化物酶(POD)活性—愈創木酚法測定[12]; 超氧化物歧化酶(SOD)活性—采用南京建成生物公司SOD試盒進行，SOD抑制率達50%為一個亞硝酸鹽單位，以u/g表示; 過氧化氫酶(CAT)活性—氧電極法[13]。土壤微生物活性和水稻生理指標皆用鮮樣測定。

2 結果與討論

2.1 不同水平外源亞鐵處理對分蘗期水稻生理指標的影響

據報道，水稻種子從發芽期開始，經歷幼苗期、 分蘗期、 拔節期這4個時期構成了水稻的第一個生長發育階段—營養生長階段。其中，水稻分蘗期是營養生長的關鍵時期，水稻-土壤-亞鐵-微生物之間相互作用、 相互影響的關系已趨于穩定。而拔節期正處于營養生長和生殖生長的交替時期，是水稻生長的敏感時期。水稻在這一生長階段受到高濃度Fe2+的毒害，抑制其細胞分裂和伸長[15]，變得矮小細弱，表現出的鐵毒脅迫癥狀尤為明顯。與植株存活率等變化一致，植株株高、 地上部干重及根系干重隨外源Fe2+濃度的增加而顯著降低。土壤環境容量協作組1991年規定， 當作物產量減產10%或20%時為重金屬毒害土壤的臨界濃度[16]。由表2分析可知，以水稻農藝性狀抑制率(y)與土壤中總Fe2+含量(x)的曲線擬合相關方程式y株高=-20.819+0.116x+4.17*10-8x3(r2=0.982)， y干物質=-222.927+42.863lnx(r2=0.993)， 分別求出株高抑制10%和20%的Fe2+臨界濃度為259.41和338.01 mg/kg(土); 干物質積累減產10%和20%時的臨界濃度分別為269.76 mg/kg和340.64 mg/kg。供試土壤的本底亞鐵含量為207.77 mg/kg(土)，當加入的外源性Fe2+濃度為100 mg/kg處理水平時，土壤總亞鐵含量符合相應臨界濃度范圍，據此可推定供試水稻土土壤亞鐵毒害的臨界濃度約為300 mg/kg(土)。變異系數反映了水稻表觀生理指標各參數對外源性鐵毒脅迫的敏感程度，由以上分析可知，水稻植株存活率與干物質積累量是鐵毒脅迫后更為敏感的生理指標。

表2 不同水平外源亞鐵處理對分蘗期水稻農藝性狀的影響

2.1.2 外源Fe2+對水稻葉綠素含量、 抗氧化酶系統活性和脯氨酸含量的影響 分蘗期處于水稻營養生長的旺盛時期，土壤—植株生態系統趨于穩定，不同濃度外源Fe2+處理對水稻的生理指標影響變化明顯(表3)。植株SPAD值與其葉綠素含量呈顯著正相關[10]，外源性Fe2+處于100 mg/kg以下較低濃度范圍時，水稻葉片SPAD值隨Fe2+濃度提高顯著增加，表觀葉色也隨Fe2+濃度的增加而加深，可能因為鐵是形成葉綠素必需的營養元素，少量鐵有利于葉綠素形成。當外源性Fe2+濃度為400 mg/kg以上時，抗氧化酶系統活性降低致使大量氧自由基擴散進入葉綠體并氧化葉綠素[20]，使葉片SPAD值逐漸下降。隨著外源Fe2+濃度的增加，土壤逆境環境增強，多種自由基生成造成氧化脅迫，POD作為植物體內清除活性氧的主要酶類，在外源性Fe2+濃度低于200 mg/kg處理以下保持平穩， 200 mg/kg處理以上快速增加。與POD的變化趨勢一致，SOD活性在外源性Fe2+濃度低于100 mg/kg處理水平時表現出小幅波動，但無顯著差異，之后顯著上升然后顯著下降，最后低于對照水平。CAT活性在外源性Fe2+濃度低于100 mg/kg 時即顯著上升到達峰值又逐漸下降至對照水平以下。植物分泌脯氨酸能夠調節細胞滲透壓和細胞氧化還原潛能，起到穩定生物大分子結構、 清除體內活性氧的作用。與POD活性變化一致，水稻脯氨酸含量隨Fe2+處理水平的增加而逐漸上升，研究結果與以往的報道相似[21]。

表3 分蘗期不同水平外源亞鐵處理后水稻生理指標的變化

2.2 不同水平外源亞鐵處理對土壤生態系統的影響

圖1 不同生育期土壤Fe2+含量的變化Fig.1 Soil Fe2+concentrations at rice growth stages

2.2.1不同生育期土壤Fe2+含量的變化 由圖1可知，土壤Fe2+含量在苗期和分蘗期與外源性Fe2+加入量成正相關關系，但由于土壤自身的緩沖作用和外界環境的氧化等影響，外源性亞鐵處理為100 mg/kg時的損失率分別為6.54%和15.97%，濃度為800 mg/kg時分別達11.34%和30.99%，損失程度隨外源亞鐵處理水平和水稻的生長發育而加強。這主要是由于隨著水稻的生長發育，外界環境溫度升高，盆口覆膜等措施不足以消除外界環境對盆栽水稻內部土壤的氧化，Fe2+被氧化的程度隨之嚴重。因此，本試驗選定水稻適應性生長的苗期和生命活動旺盛的分蘗期為研究重點，以期更準確地反映亞鐵處理對土壤-水稻-亞鐵-微生物相互作用體系的影響。

2.2.2 外源Fe2+對土壤微生物活性的影響

圖2 外源亞鐵處理對土壤微生物量碳總量的影響Fig.2 Soil microbial biomass carbon amounts under different exogenous Fe2+ treatment levels

2.2.2.2 外源 Fe2+對土壤細菌、 真菌、 放線菌總量的影響 土壤中基礎菌系包括細菌、 真菌、 放線菌三大類群微生物區系。細菌是土壤微生物中數量最多的類群，主要起到有機物分解和有機碳氮轉化的作用[24]。真菌是參與土壤中有機質分解過程的主要成員之一，能與植物共生，為植物提供養分，是生態系統健康的有效指示物。土壤中的放線菌是抗生素的主要生產菌，能夠分解土壤中的纖維素、 木質素和果膠類物質等，進而改善土壤的養分狀況，便于作物直接吸收利用土壤養分和防治病蟲害。綜上所述，基礎菌系在土壤有機質分解、 轉化過程中起到重要作用，其數量大幅減少必然導致有機質的循環礦化速度減緩，導致土壤有機質積累，養分供應失調。

圖3 外源亞鐵處理對水稻不同生育期三大基礎菌系總量的影響Fig.3 Soil basic bacteria amounts under different exogenous Fe2+ treatment levels

由圖3可知，三大基礎菌系微生物總量隨外源Fe2+濃度的增加而顯著減少，水稻分蘗期生命活動旺盛，土壤微生物反應強烈，基礎菌系微生物總量明顯高于水稻苗期生長發育階段。基礎菌系微生物總量在外源Fe2+濃度為100 mg/kg水平以下迅速減少，100 mg/kg水平以上緩慢降低。外源性Fe2+濃度為100 mg/kg較低水平時，基礎菌系微生物總量在苗期和在分蘗期分別占空白對照的77.05%和66.55%，濃度為400 mg/kg時分別僅占空白對照的45.64%和50.06%，由此可見，高濃度鐵毒脅迫導致微生物活動明顯偏弱，降低土壤有機質分解速率，造成土壤養分供應失調，不利于水稻的生長。

2.2.2.3 外源 Fe2+對土壤氨化細菌、 固氮菌、 纖維分解菌總量的影響 土壤中三大功能菌系包括氨化細菌、 固氮菌、 纖維分解菌三類，是土壤中主要的降解性微生物，能夠有效地促進土壤養分元素循環和污染物降解轉化。氨化細菌可將植物殘體中的蛋白質氨化，使土壤中不能被植物利用的有機含氮化合物轉化為有效態氮，供給植物和部分微生物同化吸收。固氮菌與植物共生能夠將大氣中氣態氮素還原為氨供植物吸收利用[25]，有效促進土壤氮素積累及植物氮素營養吸收。纖維素分解菌及其分泌的酶類物質擔負著分解植物殘體帶到土壤中的纖維素的重要功能，在生態系統碳素循環中有重要作用[26]，其分布狀況與土壤性狀、 土壤肥力有著密切的關系。因此，三大功能菌系在土壤中主要起到分解轉化有機態氮素、 固定大氣中氮素和分解纖維素的作用，但由于冷浸田土壤常年積水、 光照不足，使得其水冷土溫低，氧化還原電位較低，土體表現出強還原性，不利于上述三類好氧微生物的生長。

在水稻苗期和分蘗期階段，隨著外源性Fe2+濃度增加及其毒性的增強，土壤中三大功能菌系微生物活性受到顯著抑制，導致其微生物總量先快速減少后保持平穩降低，并在外源性Fe2+濃度為100 mg/kg時發生下降轉折點，這一結果與上述基礎菌系的變化趨勢一致。由圖4可知，外源性Fe2+濃度達200 mg/kg以上水平時，土壤中功能菌系微生物量在苗期和分蘗期平均分別僅占空白處理的43.67%和48.52%，不能夠滿足土壤中各元素循環的需要，造成土壤養分失調。此外，在較高濃度鐵毒脅迫下的功能菌總量整體呈平穩下降的趨勢，這可能是由于土壤中微生物對高濃度鐵毒脅迫的適應性機制，其機理仍需進一步研究。

2.2.2.4 外源 Fe2+對土壤鐵還原菌總量的影響 鐵還原菌(FRB)是指在生長過程中以生長基質中的Fe3+作為電子受體，氧化有機物作為電子供體，將Fe3+還原為Fe2+的厭氧或兼性厭氧微生物[27]。供試水稻土壤長期處于淹水嫌氣狀態，氧化還原電位較低，在鐵還原菌的作用下容易生成致毒性較強的還原態Fe2+。但是，隨著外源性Fe2+濃度的增加及其毒性的增強，鐵還原菌可用Fe3+相對減少，致使其異化Fe3+還原生成Fe2+的途徑減少，總量也隨之顯著降低(圖5)。

圖4 外源亞鐵處理對水稻不同生育期三大功能菌系總量的影響Fig.4 Soil functional bacteria amounts under different exogenous Fe2+ treatment levels

圖5 外源亞鐵處理對水稻不同生育期鐵還原菌總量的影響Fig.5 Soil Fe (Ⅲ)-reducing bacteria amounts under different exogenous Fe2+ treatment levels

由圖5可知，不同濃度外源Fe2+處理后，水稻不同生育期土壤鐵還原菌總量都隨外源Fe2+濃度的增加而顯著降低。水稻苗期階段，用100、 200、 400、 800和1600 mg/kg 外源Fe2+處理后，土壤可培養的微生物總量分別占空白處理的56.64%、 59.03%、 50.59%、 69.89%和40.16%。水稻分蘗期階段，各處理微生物總量分別占空白對照的77.45%、 44.69%、 48.08%、 37.70%和35.14%，各處理間差異較顯著。水稻分蘗期是營養生長的關鍵時期，土壤-亞鐵-微生物之間相互作用、 相互影響的關系已趨于穩定，此時土壤鐵還原菌總量在外源Fe2+濃度100 mg/kg以下時顯著下降，之后處于相對平穩期，總量僅達到空白處理的41.40%左右，極大減緩了土壤有機質分解，不利于作物生長發育的需要。以上結果表明，外源性Fe2+濃度在100 mg/kg以下是土壤微生物相對耐受但變化敏感的區間，應注意防治土壤Fe2+含量的繼續增長，防止鐵毒脅迫危害的增強。

2.2.3 土壤微生物活性指標在水稻不同生育期的土壤亞鐵總量半效應濃度值 土壤微生物活性對土壤環境變化反應敏感，是反映土壤污染、 表征土壤質量的重要生物學指標，其活性隨土壤污染程度的加強而逐漸減弱。歐洲經濟合作發展組織(OECD)的相關試驗(編號208)研究發現， 半效應濃度EC50是評價重金屬對植物急性毒害效應的重要參考參數[28-29]。據此，本試驗設定對微生物活性的抑制率50%為準，參考林志華[30]的研究計算土壤Fe2+總量對土壤微生物活性的抑制率，應用GraphPad Prism 5.0軟件計算出土壤微生物活性指標在水稻不同生育期的土壤亞鐵總量半效應濃度值(表4)。

由表4分析可知，水稻苗期土壤微生物活性指標的EC50存在較大差異，這可能是由于苗期階段水稻移栽入盆，土壤微生物不能適應復雜土壤環境導致，其機理還有待繼續研究。水稻分蘗期是營養生長的關鍵時期，此時土壤-亞鐵-微生物之間相互作用、 相互影響的關系已趨于穩定，多數微生物活性指標(微生物基礎菌系總量、 功能菌系總量、 鐵還原菌總量)的土壤亞鐵總量EC50達300 mg/kg，且表現出顯著相關性。供試土壤的本底亞鐵含量為207.77 mg/kg(土)，當加入的外源性Fe2+濃度為100 mg/kg處理水平時，土壤亞鐵總量符合相應臨界濃度范圍，且與水稻多數生理指標指示的臨界濃度范圍吻合，據此可推定供試水稻土土壤亞鐵毒害的臨界濃度約為300 mg/kg(土)，超出此濃度需加強農藝技術措施以防止亞鐵毒害。

2.3 不同水平外源亞鐵處理后水稻生長與土壤微生物活性的相關性分析

表5表明，不同水平外源亞鐵處理后水稻農藝性狀(單株分蘗數、 株高、 干物質積累)與其對應的水稻分蘗期土壤微生物活性指標(基礎菌總量、 功能菌總量、 鐵還原菌總量、 微生物量碳)存在極顯著正相關性，二者表征的供試土壤亞鐵毒害臨界濃度范圍吻合; 相反，以過氧化物酶活性為代表的水稻抗氧化酶系統活性和水稻脯氨酸含量與供試土壤微生物活性指標顯示出極顯著負相關性，這主要是因為它們的數量反映了水稻受環境脅迫的影響程度，隨水稻受脅迫程度而增加，這與以往的報道較為一致[31]。

表4 土壤微生物活性指標的土壤亞鐵總量半效應濃度值

表5 不同水平外源亞鐵處理后水稻生長與土壤微生物活性的相關性

上述結果表明，試驗條件下，土壤-水稻-亞鐵-微生物體系之間相互影響相互作用是同步的，繼而表現出各處理指標變化趨勢存在顯著相關性，外源亞鐵濃度超出100 mg/kg處理時開始嚴重抑制水稻生長、 降低土壤微生物活性，因此當土壤中亞鐵濃度超出一定限制后，應加強農藝技術措施防止亞鐵毒害，保證土壤-水稻-亞鐵-微生物體系的環境協調性，保障水稻正常生長所需的環境，實現水稻的穩產與高產。

3 結論

1)過量Fe2+脅迫抑制了水稻地上部和根系的生長，分蘗期植株株高和干物質積累量隨外源亞鐵處理水平的增加而顯著降低，通過曲線擬合推定導致水稻鐵毒脅迫的供試土壤亞鐵總量臨界濃度約為300 mg/kg(土)。

2)水稻其他生理指標如存活率、 單株分蘗數及抗氧化酶系統活性也能較好地反映土壤亞鐵濃度對水稻生長的影響，多數指標在外源性Fe2+濃度超出100 mg/kg(土)時出現顯著差異。供試土壤的本底亞鐵含量為207.77 mg/kg(土)，此時土壤中亞鐵總量約為300 mg/kg(土)，據此可推定供試土壤亞鐵總量達300 mg/kg(土)是影響水稻生長的濃度轉折點。

3)在土壤-水稻生態系統中，土壤微生物量碳、 微生物總量、 基礎菌(細菌、 真菌、 放線菌)總量， 功能菌(氨化細菌、 固氮菌、 纖維分解菌)總量和鐵還原菌總量都隨外源亞鐵處理水平的增大而降低，多數微生物活性指標(微生物基礎菌系總量、 功能菌系總量、 鐵還原菌總量)的土壤亞鐵總量EC50達300 mg/kg(土)，與水稻農藝性狀表征的臨界濃度吻合，從土壤微生物毒理學角度分析，也可以推定300 mg/kg(土)是供試土壤亞鐵毒害的臨界濃度。

4)在土壤-水稻-亞鐵-微生物相互作用的體系中，不同水平外源亞鐵處理后水稻生長與土壤微生物活性存在顯著相關性，表明亞鐵對土壤-水稻-微生物體系的相關影響是同步的，因此在實際農業生產中應注意土壤Fe2+的積累對土壤-水稻-微生物生態系統的影響，Fe2+含量達到產生負效應濃度時，應加強農藝技術措施以防止亞鐵毒害。

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