遮蔭對水稻冠層葉片SPAD值及光合、 形態特性參數的影響

楊 虎, 戈長水， 應 武， 楊京平*， 李金文， 何俊俊

(1 浙江大學環境與資源學院， 浙江杭州 310058； 2 杭州市農業科學研究院， 浙江杭州 310024)

光照是影響作物生長和產量的重要因素之一。Kobata[1]發現水稻在輕度遮蔭下生長狀態受影響不大，然而在重度遮蔭下產量會下降。長江中下游地區是中國水稻的主要產區之一，該地區陰雨天氣對水稻的生長發育會造成一定的影響，導致水稻產量的下降。實踐證明，水稻開花期和灌漿期光照充足，結實率和千粒重提高，產量增加; 反之，多陰雨寡光照，結實率和千粒重下降，產量降低[2]。可見光照對提高水稻產量、 發揮品種生產潛力具有重要作用。因此，探討水稻對不同光照條件的適應性機理，對充分發揮其高產特性、 提高其高產生態穩定性具有重要的科學意義。本文研究了未遮蔭及遮蔭后光照對水稻葉片光合形態生理特性的影響，探討了水稻對環境光照的適應機理。通過對未遮蔭和遮蔭條件下，冠層葉片SPAD值、 光合形態指標、 快速葉綠素熒光誘導動力學曲線的分析，深入了解光照因素對水稻冠層葉片葉綠素熒光參數光系統II(PSⅡ)的影響以及光合特征參數對環境的適應機制，為不同光照條件下，研究利用SPAD值與葉綠素熒光參數之間的關系，實時監測水稻生長與光照效應奠定良好的基礎，進一步為水稻的高效栽培和增產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗設計

實驗在浙江大學華家池校區溫室進行，水稻品種為甬優9號(YY9雜交稻)和丙9363(B9363粳稻)。人工氣候室內育秧，2009年2月10日將帶有5片葉的秧苗移栽塑料桶中，桶內裝土，土表面積為0.051 m2，每個塑料桶3叢，每叢2株幼苗，每個品種10桶，共計20桶。施氮量為225 kg/hm2(常規施肥量)，3次施肥(分蘗肥20%、 孕穗肥50%、 抽穗肥30%)，過磷酸鈣(225 kg/hm2)和氯化鉀(75 kg/hm2)在移栽的時候施入，另外75 kg/hm2的氯化鉀在移栽后40天施入。2月20日用遮陽網分別將每個品種的水稻5桶遮蔭，遮蔭時間為45天。未遮蔭和遮蔭處理環境的光合光量子通量密度(PPFD)和溫度見圖1。盆栽土壤取自杭州市農科院實驗農場，土壤質地為壤土，有機質和總氮含量分別為35.50 g/kg和2.05 g/kg。

圖1 未遮蔭和遮蔭條件下光合光量子通量密度(PPFD)和溫度的動態變化Fig.1 The dynamics of PPFD and temperature under unshaded or shaded condition

1.2 測定和分析

1.2.2 葉片厚度和SPAD值的測量 葉片厚度利用中國計量學院計量與測試學院開發的YI-20010A型葉片厚度測量儀測量。利用數顯千分尺，間接標定法進行，千分尺推動植物葉片厚度儀的傳感器測頭運動，記錄千分尺移動距離與被標定儀器YI-20010A與葉片參數儀之間的位移變化關系曲線，并對正、 返程進行了測試。由于溫度的變化會引起葉片厚度的變化[3]，因此，在葉片厚度的測量過程中保持環境溫度一致。利用SPAD-502計從2月23日起連續測量頂部完全展開葉的SPAD值，間隔時間大約為10天(根據天氣)，每個處理共測量15片葉。

1.2.3 葉片葉綠素含量的測量 待測葉片放入裝有水的塑料瓶中，一起放入4℃冰箱中。測定之前，先將葉鞘剪掉，稱重后把葉片剪碎放入25 mL比色管中，加入少許的碳酸鈣，并加適量的96%酒精浸提。將比色管放入恒溫振蕩箱中，在40℃下放置過夜后，待葉片完全變白后，將剩余的葉片過濾掉，并用酒精對葉片殘渣進行洗脫，然后再用96%的酒精標定到25 mL，最后在665nm和649nm處測定吸光度 (LAMBDA 45, 140 PerkinElmer, USA)。葉綠素a和b的計算公式為[4]：

Chlorophyll a=13.95A665-6.88A649

(1)

Chlorophyll b=24.96A649-7.32A665

(2)

Total chlorophyll=6.63A665+18.08A649

(3)

根據葉片鮮重和葉片的面積，計算水稻葉片單位面積(chlorophyll content based on per unit area)與單位鮮重(chlorophyll content based on per unit fresh weight)的葉綠素含量。

1.2.4 葉片光合特征數據測量 3月23日利用Li-6400便攜式光合測定系統(Li-Cor, Lincoln, NE, USA)測定葉片的凈光合速率(Net photosynthetic rate, Pn), 使用開放氣路, 測定前, 葉片在光合作用飽和光強下誘導大約30 min。測定時使用大氣CO2濃度, 用6400-02B LED紅藍光源控制光強, 依次設定PPFD為1200、 1000、 800、 600、 400、 200、 100、 50、 25、 0 μmol/(m2·s), 每一光強下停留200 s。

1.2.5 葉綠素熒光參數的測量 利用配置大探頭IMAG-MAX/L的調制熒光成像系統MAX- IMAGING-PAM(WALZ,德國)測量全葉片葉綠素熒光動力學。主要葉綠素熒光參數如下[5]：

Fo， 固定熒光或初始熒光產量；

Fv， 可變熒光產量；

Fm， 最大熒光產量，Fm=Fo+Fv；

ΦPS II， 實際光化學效率，ΦPSII=(Fm′-F)/Fm′。

相對電子傳遞速率(electron transport rate, ETR)：ETR=ΦPSII·PPFD·0.5×0.84，其中0.5是假設吸收的光被兩個光系統均分得到的參數,0.84是吸光系數。

ETR隨PPFD的變化圖像為光響應曲線，即使光化光的持續時間短至10 s，也可得出典型的光響應曲線，這被稱為快速光曲線(rapid light curve, RLC)。為了測定不同光照梯度下葉片的RLC，設置光照梯度為0、 20、 55、 110、 185、 280、 395、 460、 541、 602、 700、 800和925μmol/(m2·s)，間隔時間為10 s。為對RLC進行量化描述，根據Plaat[6]等的方程進行曲線擬合：

P=Pm·(1-ea·PPFD/Pm)·e-β·PPFD/Pm

(4)

其中，P是相對電子傳遞速率； Pm是潛在的最大光合速率； a為初始斜率，反映了光能的利用效率； β為光抑制參數，高光強下下降部分的斜率。

1.2.6 數據分析 未遮蔭或遮蔭處理下葉片生理形態數據利用SPSS16.0 (SPSS for windows, Version 16.0, USA) 單因素方差分析進行0.05水平的Duncan’s-test統計分析，曲線擬合采用SPSS的Nonlinear模塊和Origin8.0進行分析。

2 結果與分析

2.1 遮蔭對水稻冠層葉片SPAD值、 葉綠素含量和生理形態特征的影響

圖2 未遮蔭和遮蔭條件下甬優9號(A)和丙9363(B)葉片SPAD值的動態變化Fig.2 The dynamics of SPAD readings of YY 9 (A) and B 9363(B) under unshaded and shaded condition

表1 不同光照處理甬優9號和丙9363的比葉重(g/m2)、 葉片厚度(μm)、 葉綠素含量和葉綠素a/b

2.2 遮蔭對水稻冠層葉片光合特征的影響

遮蔭使得兩個品種的最大凈光合均顯著下降(表2)，遮蔭條件下，丙9363的氣孔導度無顯著變化，表明丙9363氣孔導度對遮蔭有一定的補償作用,但是甬優9號的氣孔導度卻顯著下降。同樣，遮蔭對丙9363胞間CO2和蒸騰速率無顯著影響，但卻顯著降低了甬優9號胞間CO2濃度和蒸騰速度，可能是氣孔導度與胞間CO2濃度和蒸騰速率密切相關，蒸騰速率的下降會導致胞間CO2濃度和氣孔導度的下降，從而導致了最大凈光合的下降。

表2 未遮蔭和遮蔭條件下甬優9號和丙9363葉片光合交換特征

圖3表明，隨著PPFD的增加，兩個水稻品種的葉片光響應曲線逐漸增大，遮蔭顯著降低了最大凈光合速率(Pmax)，量子效率，光補償點和光飽和點，表明遮蔭導致水稻的光合能力下降(表3)。葉片的呼吸速率下降是為了適應弱光照環境，大幅度減少了自身的呼吸消耗，以增加對有限光能的利用。遮蔭時，Pn的降低是光照強度、 葉綠素含量、 氣孔和光系統光能分配自我調節共同作用的結果。遮蔭后葉片光補償點和光飽和點降低，表明遮蔭導致葉片光合系統的暗反應效率下降，對光能的需求降低[10]。

圖3 未遮蔭和遮蔭甬優9號(A)與丙9363(B)的光響應曲線Fig.3 Light response curve of YY9 and B 9363 under shading or unshading conditions

表3 未遮蔭和遮蔭條件下甬優9號和丙9363的光響應曲線擬合結果

圖4 甬優9號(A)和丙9363(B)的快速光曲線Fig.4 Rapid light curves of YY 9 (A) and B 9363 (B)

2.3 遮蔭對水稻冠層葉片葉綠素熒光參數的影響

2.3.1 未遮陰與遮陰條件下水稻冠層葉片的快速光曲線 由圖4可知，遮蔭對快速光曲線的初始斜率的影響不大，說明遮蔭對水稻捕光系統無明顯影響。由表4可知，未遮蔭與遮蔭條件下，光抑制系數均非常小，說明光抑制發生不明顯。然而遮蔭條件下，潛在最大電子傳遞速率顯著下降，說明遮蔭使電子傳遞能力減弱，這可能是葉片光合能力下降的原因。ΦPSII不僅與碳同化有關,也與光呼吸及依賴O2的電子流有關，代表線性電子傳遞的量子效率[11]。

表4 圖4擬合的結果

2.3.2 未遮蔭和遮蔭條件下水稻冠層葉片PS II的最大量子產量(Fv/Fm) 遮蔭條件下，兩個水稻品種F0均較高(圖5A)， 這同牟會榮等[12](2008)研究的結果類似。遮蔭降低了兩個水稻品種的Fm和Fv/Fm(圖5B,C)，Fv/Fm值下降表明遮蔭降低了葉片最大光化學效率。光照過弱會使PSII原初光能轉化效率下降，抑制了水稻光合作用的原初反應，進而影響光合作用整個過程。遮蔭降低了Fm(圖5C)，說明遮蔭對PSII的電子傳遞產生影響，Fm是暗適應的光合機構全部PSⅡ反應中心處于完全關閉時的熒光產量，Fm反映PSⅡ的電子傳遞情況[13]。

2.3.3 不同光照水平下水稻冠層葉片SPAD值與PS IIFv/Fm之間的關系 通過對不同光照水平下，兩個水稻品種冠層葉片SPAD值與PS II的Fv/Fm之間關系的擬合發現，隨著SPAD值的增大，PS II的Fv/Fm呈現出先增大后趨向于穩定的現象，形成了指數式模型關系式(圖6)。光合作用過程中，Fv/Fm與O2轉化的量子產量成正相關關系，其最大值在0.85左右說明PS II正處于高效的激發能狀態，此時葉片處于未遮蔭狀態，葉片SPAD值相對較高。根據兩個品種的SPAD值與Fv/Fm擬合的回歸模型計算結果可知，SPAD值大約為35時，Fv/Fm開始出現明顯下降的趨勢，所以，當SPAD 值小于35時，葉片PS II可能處于受損狀態中。Kumagai等[14]研究水稻葉片SPAD值與Fv/Fm之間的回歸模型發現當SPAD值在30左右，PS II可能處于受損的狀態，這可能是由于不同水稻品種和生長環境產生的差異。由圖6可知，未遮蔭條件下，水稻冠層葉片的SPAD值可以作為PS II的Fv/Fm的指示。

圖5 未遮蔭和遮蔭情況下甬優9號和丙9363的F0(A)、 Fv/Fm(B)和Fm(C) Fig.5 F0 (A), Fv/Fm (B) and Fm(C) of YY9 and B9363 under different shading treatments

圖6 未遮蔭和遮蔭條件下水稻冠層葉片SPAD值與PSII的Fv/Fm之間的關系(A: YY9; B: B9363) Fig.6 Correlation between the SPAD readings and Fv/Fm of PSII in canopy leaves of rice plants in different lighting conditions (A: YY9; B: B9363)

3 討論和結論

對于光照的響應，不同品種的水稻葉片SPAD值不同。有的品種對于光照的時間具有一定的耐受性，同時要考慮種植密度對葉片SPAD值的影響。總之，不管什么水稻品種，遮蔭都會顯著降低其冠層葉片SPAD值，延緩其生長，只是個別品種耐蔭強，其冠層葉片SPAD值變化較小。葉片SPAD值與葉綠素含量成正比，而葉片葉綠素含量又與氮含量密切相關，通常SPAD值被用來衡量葉片氮含量的高低[14-15]。遮蔭條件下，水稻葉片變薄，葉綠素a/b和最大凈光合速率下降，導致CO2同化速率和氮的吸收率降低[16-17]，進一步解釋了SPAD值變小的原因。由此可見，SPAD值可以反映由光照時間的不同引起的葉片氮素含量的高低。葉綠素a/b值同葉片所接受的光照密切相關，遮蔭條件下，葉片葉綠素a/b降低(表1)。可見，葉綠素a/b可以反映冠層葉片的光照情況。大豆葉片中，葉綠素a/b值在品種間存在一些差異[18]，然而不同水稻品種間，葉綠素a/b是否存在顯著差異，還需要大量的田間試驗給予證實。葉綠素熒光動力學方法可以快速、 靈敏、 無損傷地探測光照對植物光合生理的影響，光照條件與植物熒光參數Fv/Fm、 Fv/Fo、 ΦPSII等的受抑制程度密切相關。本試驗結果表明，遮蔭降低了甬優9號和丙9363葉片的ΦPSII，這可能是促使ETR降低的原因，也可能是改變光合特征的重要原因之一。遮蔭對水稻葉綠素熒光參數ETR有不同程度的降低(圖4)，說明遮蔭條件下，水稻葉片吸收的光能往往達不到其固定CO2所需的能量，從而降低其所產生激發能。這些激發能滿足不了自身體內細胞活動的基本需求，無法產生足夠的活性氧，從而降低了PSII的反應中心和原初光化學反應。結果進一步證實，葉綠素熒光技術可以簡便、 快速地測定出植株光合作用的變化，從而尋找到植物生長發育最適宜的營養環境。

Fv/Fm是光化學效率的指標，非環境脅迫下其極少變化，而且不受物種和自身條件的影響，通常在0.8左右，遭受光抑制后，葉片的Fv/Fm明顯下降。本試驗表明水稻葉片SPAD值與Fv/Fm表現出指數式回歸關系，這同Kumagai等[14]對水稻的研究結果類似，Netto等[19]在對咖啡樹的研究中發現，當SPAD值小于40的時候，Fv/Fm值顯著下降，這也表明水稻葉片SAPD值可以間接地用于水稻冠層葉片光合能力的指示。這是因為葉片Fv/Fm與二磷酸核酮糖羧化酶含量表現出指數式回歸關系，而二磷酸核酮糖羧化酶與葉片同化CO2的能力正相關，而葉片同化CO2的能力又與PSII中的光合電子傳遞功能密切相關[14,17]。然而，本文只研究了未遮蔭和遮蔭下水稻冠層葉片SPAD值與葉綠素熒光參數(Fv/Fm)之間粗略的關系，以及葉片葉綠素熒光參數和生理生態特征的變化情況，至于在不同強度和時長的光照條件下，水稻冠層葉片葉綠素熒光參數和其他生理生態特征會發生怎樣的變化，是否能通過SPAD計對葉綠素熒光參數進行精準的預測，還需要進一步的研究探討。

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