半薄切片技術實踐探討

胡基華，李 晶，2，張淑梅，2，孟力強，2，曹 旭，2

(1．黑龍江省科學院微生物研究所，哈爾濱150020;2．黑龍江省科學院高技術研究所，哈爾濱150010)

隨著透射電子顯微鏡在科學研究中的廣泛應用，已經成為觀察組織細胞超微結構的一種手段，生物標本的制備，也是下一步結構觀察和獲得好結果的前提。但是，由于切片太小，有時難于觀察到目標結構，為此需大量制備樣品，造成工作量大而且消耗多。為使超薄切片能精確地切到目標部位，在做超薄切片前，首先要先做半薄切片來進行定位［1］。半薄切片(厚度0．6 ～0．8μm)的制備是一種常用制樣手段，已經應用在胚胎學、病理學及動植物細胞學研究中。

半薄切片的制備在取材、固定、漂洗脫水、滲透包埋、切片和染色的每一個步驟，都很關鍵，任何環節的疏忽都會導致制片的失敗。目前多采用環氧樹脂和塑料包埋介質，由于后者對組織和細胞結構的保存較差，難以達到電鏡觀察的要求。同一樣本若要作電鏡觀察又須進行光鏡檢查，環氧樹脂包埋組織的方法能達到上述目的［2］。

1 固定液的選擇和半薄切片的制備

固定液一般選擇FAA固定液和卡諾固定液。FAA固定液(福爾馬林5 mL，冰醋酸5 mL，70%酒精90 mL)一般適用固定植物根、莖、葉、花藥和子房組織。值得注意的是幼嫩材料應選用50%的酒精代替70%酒精，防止材料收縮;在固定液中加入5%甘油可防固定液蒸發和材料變硬;卡諾固定液(純酒精15 mL，冰醋酸5 mL或者純酒精30 mL，氯仿5 mL，冰醋酸1 mL)，滲透迅速，但是固定時間不能太久，一般不超過1d。伊麗米努爾等使用不同濃度梯度的乙醇為胡楊種子脫水的實驗表明，胡楊種子在4℃的70%酒精中可放置較長的時間，固定較快，對胡楊種子細胞內各種結構及其內含物有較好的固定作用［3］。

半薄切片的制備，可直接在超薄切片機上進行，也可以在半薄切片機上進行，切片時要注意刀口是否鋒利，實驗表明鈍的刀口切出的片子易發生皺并且在光鏡下有切痕，影響觀察效果［4］。

2 脫樹脂、脂堿

半薄切片常規染色方法有甲苯胺蘭染色法、天青/美蘭染色法、堿性復紅法、蘇木素—伊紅法、H，E染色法和Giemsa染色法等。無論哪種方法都需要預先做好脫樹脂處理，否則染料不宜滲入，影響染色效果。脫樹脂使用的是NaOH的乙醇飽和溶液，脫樹脂成功的標志是切片中組織周圍的樹脂已脫落，組織上顏色變淡，平展附著于載玻片上，無發皺、起卷現象，脫樹脂過程中，可以隨時夾出切片在光線下觀察效果。脫的不夠片子染色較淡，脫的太快，半薄切片容易從載玻片上脫落。載玻片黏附性可以避免掉片，是操作過程中不可忽視的環節，正確配制脫樹脂試劑才能達到良好的去除樹脂效果。而另一個避免脫片的關鍵是掌握好脫樹脂的時間，這些將有助于樹脂包埋樣品用于光鏡方面的觀察與研究，使電鏡樣品不但可用于電鏡方面的超微結構的研究，同時可進行光鏡方面的研究。于紅麗等用飽和氫氧化鈉無水乙醇液與甲苯按3∶1混合液脫樹脂，所需時間僅 5 min，樹脂完全脫凈［5］。

3 染色

選擇理想的染色劑非常重要。一般細胞壁的染料有酸性品紅、番紅、固綠、甲苯胺藍、蘇木精、結晶紫、亮綠、蘇丹Ⅳ等。細胞核染料(堿性)有堿性品紅、蘇木精、洋紅、番紅、地衣紅和結晶紫等。細胞質染料(酸性)有酸性品紅、甲苯胺藍、曙紅、固綠和苦味酸等。要遵循先用堿性染料再使用酸性染料的順序，例如，對植物材料染色，使用番紅—固綠對染法，木質化的細胞壁及細胞核呈紅色，纖維素的細胞壁及細胞壁呈綠色;使用鐵礬蘇木精法，作為細胞一般結構及細胞分裂時期的優良染劑，可使用鐵礬蘇木精法，細胞分裂時期的染色體呈黑色。PAS(高碘酸—席夫)法染色，可將纖維素細胞壁及淀粉染成紅色，植物組織會呈不同程度的紅色［6］。

4 結語

隨著電子顯微鏡技術的發展，在工業、農業、環境科學，尤其是在生物醫學、計量醫學、遠程病理診斷等領域都得到廣泛的應用。在整個電子顯微鏡技術中，切片制備的優劣直接反映在超薄切片上。影響切片質量的因素很多，在實際研究中，電鏡標本制備是得到高質量超薄切片的工作難點，同時又是技術的關鍵。這就要求在實驗中不斷總結經驗，根據不同的材料性質和觀察目的，改良舊的方法，摸索新的方法，使這項技術日趨完善成熟。

［1］ 蔣海鷹，沈明，馮德云．環氧樹脂包埋半薄切片脫樹脂新方法［J］．湖南醫科大學學報，2000，25(1):85—86．

［2］ 唐海蘭，黃中新．環氧樹脂包埋塊半薄切片進行免疫組化染色的方法［J］．暨南大學學報 1997，18(4):9—12．

［3］ 伊麗米努爾，Kurt Zogauer，Bernd Cyffca，史軍輝．改良半薄切片法觀察胡楊種子結構［J］．西部林業科學，2013，42(2):26—30．

［4］ 楊興龍，申洪．電鏡樣品半薄切片HE染色前脫樹脂的技術處理［J］．黑龍江醫藥科學，2002，25(3):58—59．

［5］ 于紅麗，張大紅，徐夏紅，等．電鏡半薄切片制備方法的改進［J］．徐州醫學院學報，2004，24(2):129—130．

［6］ 周馥，邢樹平．介紹一種半薄切片定位樣品的方法［J］．植物學通報，1999，17(3):274—275．