制造工藝對益生菌健康效應的影響及其啟示

劉茂柯，唐玉明，曹曉涵，任道群，姚萬春，敖曉琳

（1.四川省農業科學院水稻高粱研究所生物中心，四川瀘州646100；2.四川農業大學生命科學與理學院，四川雅安625014；3.四川農業大學食品學院，四川雅安625014）

近年來，隨著微生態技術的發展，益生菌應用于食品、藥物的成果日益增加，新產品層出不窮。然而，由于活菌數對益生菌產品功效具有基礎性作用，使得相關產品的研發主要致力于如何提高活菌數，而易忽視制造工藝對益生菌健康效應存在的巨大影響[1]。還有研究顯示，制造過程中若盲目追求提高益生菌活菌數，可能會導致健康效應的衰退，降低產品功效[2]。因此，除活菌數外，應對產品制造過程中影響益生菌健康效應的其他因素投入更多的關注，合理調整工藝，方能使益生菌在宿主體內更高效地起到有益效果，推動益生菌產品的功效朝所期待的方向發展。

1 制造工藝對益生菌健康效應的影響

1.1 生長培養基

益生菌健康效應的體現高度依賴對生長培養基的選擇。不同培養基培養的益生菌在拮抗病原菌[3]、免疫調節[4]和降解膽固醇[5]等方面的能力均有差異。例如，M17培養的L.lactis G50誘導小鼠巨噬細胞產生干擾素IL-12的能力顯著強于MRS培養[4]，而在MRS中生長的L.johnsonii NCC 533對沙門氏菌的拮抗作用明顯高于MLM+培養[6]。

培養基營養成分的不同可改變益生菌代謝途徑，造成細胞表面與生理功能相關的糖蛋白、脂肪酸等分子種類、構象發生變化進而造成健康效應的差異。如在生長培養基中添加不同的碳源、氮源以及無機鹽可影響抗菌素的生成，使菌株顯示出不同的拮抗能力[3，7]。而添加不同脂肪酸可能導致菌株細胞表面非飽和與飽和脂肪酸的比率發生變化，改變細胞膜疏水性，影響腸道黏附性和拮抗能力[6]。

1.2 pH

培養pH對益生菌健康效應有很大影響。一方面，培養pH的變化可影響相關代謝產物的合成與分泌。例如，抗菌素的產生對pH具有高度易感性，使得不同pH條件下培養的菌株拮抗能力有所不同[3，7]。還有研究證實，與益生菌耐膽鹽和降解膽固醇能力相關的膽酸鹽水解酶的活性[8]以及具有腫瘤生長抑制作用的精氨酸脫亞胺酶的分泌[9]也高度依賴pH的調控。另一方面，Sashihara等[10]認為培養環境中的H+對肽聚糖的構象可能起到修飾作用，從而影響菌株免疫調節功能。在他們的研究中，不同pH培養的L.gasseriOLL2809誘導小鼠脾細胞白介素IL-12（P70）的分泌量分別約為：500 pg/mL（pH6）、1000pg/mL（pH5）、1800pg/mL（pH4）。

1.3 生長期

益生菌在不同生長期健康效應的作用機理不同[11-13]。如Maassen等[11]分別向小鼠飼喂對數期和生長期的乳酸菌后接種疫苗，兩個處理間血清IgG1/IgG2a比率呈現顯著差異，表明不同生長期乳酸菌可能決定疫苗誘導的免疫應答是偏向于Th1還是Th2型，進而造成免疫應答類型的不同。目前的研究顯示，益生菌在穩定期時，其黏附[13]、拮抗[3]與免疫調節能力[10]相對較強，原因是細胞表面物質如疏水性蛋白、聚糖類物質等均在此時分化成熟。此外，穩定期不同時間點收獲的菌株各方面表現也不同。例如L.rhamnosus GG對Caco-2黏附性以穩定期前期最強[13]。而L.gasseri OLL2809誘導鼠脾細胞白介素IL-12（P70）的分泌量在穩定期后期達到最高[10]。

1.4 培養溫度

已有研究顯示，培養溫度對益生菌抗菌能力有較大影響。如在20、30、40℃條件下培養的L.rhamnosus GP1對哈氏弧菌的抗菌效價分別為420、1 200 AU/mL與200 AU/mL[7]。而有關培養溫度對其他健康效應有何影響的報道較少。現已證實培養溫度對胞外多糖（EPS）的富集有顯著影響[14]，而胞外多糖在益生菌黏附、免疫調節與消除細胞病變中起重要作用[15-17]，但尚缺乏直接的證據將兩者聯系起來。

1.5 載體

研究顯示，與不同載體配伍，益生菌在治療關節炎[18]、抑制幽門螺桿菌[19]以及抗腫瘤[20]等方面的表現不同。說明了載體對健康效應存在影響，但相關作用機理尚不清楚。可能的機理之一是載體可降低不利環境因素的脅迫作用對益生菌生理功能造成的傷害，使活菌數和細胞結構得以保持。Saxelin等[21]將復合益生菌制成膠囊、酸奶酪與干酪3種形式，讓成年人以1010cfu/d的劑量服用四周，停用后各處理糞便中B.lactis Bb12活菌數呈現出極顯著的差異，揭示了載體對定植力的影響。還有研究顯示將益生菌與脫脂乳配伍，脫脂乳中的蛋白質可分散高壓勻漿過程中的壓力，降低其對細胞膜疏水性造成的影響，使黏附性得到保持[22]。

另一可能的機理是載體所含的生物活性物質與益生菌之間存在協同作用。Larsen等[23]在體外試驗中發現Ca2+可促進益生菌黏附性和拮抗能力增強。Sachdeva等[19]在研究中指出，以富含Ca2+的乳制品為載體可使益生菌在人體內對幽門螺桿菌的抑制作用較其他載體提升5%到10%。這可能也是目前益生菌食品主要以乳制品為載體的原因之一。

1.6 其他

Vinderola等[24]發現不同香型發酵乳制品中L.casei的胃腸道耐受性有較大差異。因此，他推測食品添加劑對健康效應有一定影響，但他檢測的樣品來源于不同廠商，這種差異是否僅由香味劑所引起尚有待證實。此外，對于復合益生菌產品，菌株配伍方式也存在較大影響。例如，將B.lactis Bb12與L.rhamnosusGG進行配伍，可使L.rhamnosus GG的腸道黏附性顯著提高，免疫調節效應得到加強[25]。但若將L.rhamnosus LC705或B.breve Bb99與其進行組合，則可能導致完全相反的結果[26]。

2 益生菌產品研發應注意的問題

益生菌產品功效主要取決于活菌數基礎上菌株健康效應的展現。然而制造工藝對健康效應存在的巨大影響，可能產生某一工藝措施在提高活菌數的同時卻導致健康效應的衰退，這是易被忽視的問題。

研究發現，對數期的L.rhamnosus GG抗逆性顯著強于穩定期[27]，但此時其腸道黏附性相對于穩定期時卻顯著下降[13]。若將對數期的培養物用于產品研發，雖利于活菌數的提高，但也可能減弱其免疫調節效應。Burns等[2]的研究印證了這一觀點。他們發現，對L.lactis 200進行耐膽鹽馴化雖可提高其腸道存活率，但會造成細胞膜完整性的缺失，使疏水性和凝集作用下降，導致免疫調節效應受損。因此，對工藝的調整應考慮到對活菌數和健康效應的兼顧，做到全局優化。例如，酸馴化可促進細胞膜飽和脂肪酸的富集提高菌株抗逆性[28]，但脂肪酸結構的改變將導致細胞膜疏水性變化，影響到腸道黏附性[6]。生長培養基中添加甘露糖可提高菌株凍干和存儲期的活菌數[29]，同時這對抗菌素的產生[3，7]、EPS[30]的形成將帶來何種影響都是須注意的問題。

因此，若能在深入解析益生菌生理功能的基礎上，將相關作用機制靈活應用于對制造工藝的優化中，目的和手段有效結合，有所兼顧，有的放矢，方能使益生菌產品的功效得到增強。

3 如何提高益生菌產品的功效

3.1 利用健康效應的作用機制

益生菌健康效應的展現主要與細胞表面物質、代謝產物以及特殊DNA序列有關[31]。調整工藝使相關作用機理得以保持是提升產品功效的有效措施。例如，Sashihara等[10]指出雖然在pH 5.5～6.5環境下培養有利于獲得益生菌細胞產量和初級代謝產物，但在此基礎上適當降低pH并將益生菌培養至穩定期更有利于肽聚糖的成熟，使免疫調節效應得到提升。類似的結論在隨后的研究中得到[3，13，32]。而 Roy 等[33]通過基因重組對益生菌細胞表面受體進行設計來阻斷病原菌對腸道細胞的結合也取得了較好的效果。另外，對相關作用機理的研究應注重對共性的把握。其中，黏附性被認為是益生菌在體內發揮健康效應的關鍵，與之相關的細胞表面物質如EPS[15]、S-layer[34]以及菌毛蛋白[35]等是值得重點研究的對象。

3.2 利用抗逆性的生理機制

F1F0 ATPase是益生菌在逆境中維持自身內穩態的關鍵酶，研究顯示通過耐酸[36]、耐膽鹽[37]馴化均可促進此酶的表達與活性的提高進而提升菌株抗逆性。Ongol等[38]則采用新霉素誘變的方式來減弱L.bulgaricus中該酶的活性，降低乳制品后酸化作用，使B.breve的活菌數在存儲期顯著提高。這提示，深入研究益生菌抗逆性的生理機制，可為提升活菌數帶來更多的工藝措施，使對工藝的選擇更靈活、更具針對性。例如，L.rhamnosus是運用較廣的益生菌，但由于其缺乏過氧化氫酶，使得相關產品的活菌數難以維持。An等[39]將該菌與L.sakei YSI8中表達過氧化氫酶的KatA進行重組，使其在有氧培養條件下活菌數提高100倍左右，同時健康效應也得到保持。

3.3 利用生理功能的相關性

利用益生菌生理功能的相關性，從側面對菌株進行改造可為工藝調整提供更多的切入點。如前所述，適應性馴化提高菌株抗逆性的機制之一是其有利于F1F0 ATPase的表達與活性的提高。F1F0 ATPase的活性需消耗大量ATP來維持。因此，抗逆性較強的菌株往往伴隨著相對旺盛的糖酵解能力[27]。所以，在適應性馴化可能損傷菌株健康效應時，借鑒Fu等[40]的方法通過代謝工程手段針對糖酵解途徑進行調控來提高其抗逆性也是值得嘗試的。同時，這也提示，優化培養條件提升益生菌抗逆性時，為其提供更多的營養物質可能會取得更好的效果。

3.4 加強產品臨床效果研究

對大多數消費者而言，對益生菌產品的使用方式是影響其功效的主要因素。Tsai等[41]向小鼠飼喂L.paracasei NTU 101（108cfu/d），其拮抗與免疫調節效應在連續飼喂6周后才有所體現，連續飼喂9周后方能使健康效應在停飼后維持一段時間。這說明健康效應的展現具有時間依賴性，而使用時間長短還可能造成相關的作用機制發生轉變[42]。然而目前臨床研究的試驗期普遍較短，尤其缺乏對益生菌健康效應隨使用時間變化的動態結果，造成相關產品具體功效的標識不明確，間接導致了消費者對產品的使用方式具有隨意性的特點，造成功效的不確定性。

3.5 完善產品質量評價體系

除活菌數外，應將腸道黏附性、拮抗、免疫調節等納入質量評價體系當中，針對產品所標示的具體健康功效進行鑒定。此外，為避免因材料方法的不同導致對菌株功能評價結果出現差異，對鑒定方法的選擇應具有多元化。

4 結語

目前，益生菌產品研發需要解決的問題是在深入解析益生菌生理功能的同時加大對制造工藝學的研究力度。在此基礎上，合理兼顧益生菌活菌數與健康效應之間的關系，全局優化，這對提升益生菌產品的功效、推動益生菌產業的發展具有重要的理論和應用價值。隨著相關研究的深入，益生菌產品將進一步發揮對人類健康的促進作用。

[1]Grzeskowiak L,Isolauri E,Salminen S,et al.Manufacturing process influences properties of probiotic bacteria[J].Br J Nutr,2011,105(6):887-894

[2]Burns P,Reinheimer J,Vinderola G.Impact of bile salt adaptation of Lactobacillus delbrueckii subsp.lactis 200 on its interaction capacity with the gut[J].Research in Microbiology,2011,162(8):782-790

[3]Khalil R,Djadouni F,Elbahloul Y,et al.The influence of cultural and physical conditions on the antimicrobial activity of bacteriocin produced by a newly isolated Bacillus megaterium 22 strain[J].African Journal of Food Science,2009,3(1):011-022

[4]Kimoto-Nira H,Suzuki C,Kobayashi M,et al.Different growth media alter the induction of interleukin 12 by a Lactococcus lactis strain[J].Journal of Food Protection,2008,71(10):2124-2128

[5]Lye H S,Rahmat-Ali G R,Liong M T.Mechanisms of cholesterol removal by lactobacilli under conditions that mimic the human gastrointestinal tract[J].International Dairy Journal,2010,20(3):169-175

[6]Muller J,Ross R,Sybesma W,et al.Modification of the Technical Properties of Lactobacillus johnsonii NCC 533 by Supplementing the Growth Medium with Unsaturated Fatty Acids[J].Applied and Environmental Microbiology,2011,77(19):6889-6898

[7]Sarika A,Lipton A,Aishwarya M.Bacteriocin production by a new isolate of Lactobacillus rhamnosus GP1 under different culture conditions[J].Adv J Food Sci Technol,2010,2(5):291-297

[8]Kumar R,Grover S,Batish V K.Hypocholesterolaemic effect of dietary inclusion of two putative probiotic bile salt hydrolase-producing Lactobacillus plantarum strains in Sprague-Dawley rats[J].British Journal of Nutrition,2011,105(4):561

[9]Rimaux T,Rivière A,Illeghems K,et al.Expression of the arginine deiminase pathway genes in Lactobacillus sakei is strain-dependent and is affected by environmental pH[J].Applied and Environmental Microbiology,2012,78(14):4874-4883

[10]Sashihara T,Sueki N,Furuichi K,et al.Effect of growth conditions of Lactobacillus gasseri OLL2809 on the immunostimulatory activity for production of interleukin-12(p70)by murine splenocytes[J].International Journal of Food Microbiology,2007,120(3):274-281

[11]Maassen C,Boersma W J A,van Holten-Neelen C,et al.Growth phase of orally administered Lactobacillus strains differentially affects IgG1/IgG2a ratio for soluble antigens:implications for vaccine development[J].Vaccine,2003,21(21/22):2751-2757

[12]Van Baarlen P,Troost F J,Van Hemert S,et al.Differential NFKB pathways induction by Lactobacillus plantarum in the duodenum of healthy humans correlating with immune tolerance[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,2009,106(7):2371

[13]Deepika G,Green R J,Frazier R A,et al.Effect of growth time on the surface and adhesion properties of Lactobacillus rhamnosus GG[J].Journal of Applied Microbiology,2009,107(4):1230-1240

[14]Aslim B,Yuksekdag Z N,Beyatli Y,et al.Exopolysaccharide production by Lactobacillus delbruckii subsp.bulgaricus and Streptococcus thermophilus strains under different growth conditions[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,2005,21(5):673-677

[15]Fanning S,Hall L J,Cronin M,et al.Bifidobacterial surface-exopolysaccharide facilitates commensal-host interaction through immune modulation and pathogen protection[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,2012,109(6):2108-2113

[16]Lebeer S,Claes I J J,Verhoeven T L A,et al.Exopolysaccharides of Lactobacillus rhamnosus GG form a protective shield against innateimmunefactorsintheintestine[J].MicrobialBiotechnology,2011,4(3):368-374

[17]Ruas-Madiedo P,Medrano M,Salazar N,et al.Exopolysaccharides produced by Lactobacillus and Bifidobacterium strains abrogate in vitro the cytotoxic effect of bacterial toxins on eukaryotic cells[J].Journal of Applied Microbiology,2010,109(6):2079-2086

[18]Baharav E,Mor F,Halpern M,et al.Lactobacillus GG bacteria ameliorate arthritis in Lewis rats[J].The Journal of nutrition,2004,134(8):1964-1969

[19]Sachdeva A,Nagpal J.Effect of fermented milk-based probiotic preparations on Helicobacter pylori eradication:a systematic review and meta-analysis of randomized-controlled trials[J].European journal of gastroenterology&hepatology,2009,21(1):45

[20]Urbanska A M,Bhathena J,Martoni C,et al.Estimation of the potential antitumor activity of microencapsulated Lactobacillus acidophilus yogurt formulation in the attenuation of tumorigenesis in Apc(Min/+)mice[J].Digestive diseases and sciences,2009,54(2):264-273

[21]Saxelin M,Lassig A,Karjalainen H,et al.Persistence of probiotic strains in the gastrointestinal tract when administered as capsules,yoghurt,or cheese[J].International Journal of Food Microbiology,2010,144(2):293-300

[22]Lanciotti R,Patrignani F,Iucci L,et al.Potential of high pressure homogenization in the control and enhancement of proteolytic and fermentative activities of some Lactobacillus species[J].Food chemistry,2007,102(2):542-550

[23]Larsen N,Nissen P,Willats W G T.The effect of calcium ions on adhesion and competitive exclusion of Lactobacillus ssp.and E.coli O138[J].International Journal of Food Microbiology,2007,114(1):113-119

[24]Vinderola G,Cespedes M,Mateolli D,et al.Changes in gastric resistance of Lactobacillus casei in flavoured commercial fermented milks during refrigerated storage[J].International Journal of Dairy Technology,2011,64(2):269-275

[25]Ouwehand A,Isolauri E,Kirjavainen P,et al.The mucus binding of Bifidobacterium lactis Bb12 is enhanced in the presence of Lactobacillus GG and Lact.delbrueckii subsp.bulgaricus[J].Lettersinapplied microbiology,2000,30(1):10-13

[26]Kukkonen K,Savilahti E,Haahtela T,et al.Long-term safety and impact on infection rates of postnatal probiotic and prebiotic(synbi－otic)treatment:randomized,double-blind,placebo-controlled trial[J].Pediatrics,2008,122(1):8-12

[27]Ampatzoglou A,Schurr B,Deepika G,et al.Influence of fermentation on the acid tolerance and freeze drying survival of Lactobacillus rhamnosus GG[J].Biochemical Engineering Journal,2010,52(1):65-70

[28]Broadbent J R,Larsen R L,Deibel V,et al.Physiological and transcriptional response of Lactobacillus casei ATCC 334 to acid stress[J].Journal of Bacteriology,2011,192(9):2445-2458

[29]Carvalho A S,Silva J,Ho P,et al.Effects of Various Sugars Added to Growth and Drying Media upon Thermotolerance and Survival throughout Storage of Freeze-Dried lactobacillus delbrueckii ssp.bulgaricus[J].Biotechnology progress,2004,20(1):248-254

[30]Garrido D,Kim J H,German J B,et al.Oligosaccharide binding proteins from Bifidobacterium longum subsp.infantis reveal a preference for host glycans[J].PLoS One,2011,6(3):e17315

[31]Li Z,Li G,Liu H,et al.The analysis of the impacting factors of probiotics on immune responses[J].African Journal of Microbiology Research,2012,6(11):2735-2743

[32]Marianelli C,Cifani N,Pasquali P.Evaluation of antimicrobial activity of probiotic bacteria against Salmonella enterica subsp.enterica serovar typhimurium 1344 in a common medium under different environmental conditions[J].Research in Microbiology,2010,161(8):673-680

[33]Roy D S,Colin H.Rational Design of Improved Pharmabiotics[J].Journal of Biomedicine and Biotechnology,2009,doi:10.1155/2009/275287

[34]Konstantinov S R,Smidt H,De Vos W M,et al.S layer protein A of Lactobacillus acidophilus NCFM regulates immature dendritic cell and T cell functions[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,2008,105(49):19474-19479

[35]Lebeer S,Claes I,Tytgat H L P,et al.Functional Analysis of Lactobacillus rhamnosus GG Pili in Relation to Adhesion and Immunomodulatory Interactions with Intestinal Epithelial Cells[J].Applied and Environmental Microbiology,2012,78(1):185-193

[36]Waddington L,Cyr T,Hefford M,et al.Understanding the acid tolerance response of bifidobacteria[J].Journal of Applied Microbiology,2010,108(4):1408-1420.

[37]Sánchez B,De Los Reyes-Gavilán C G,Margolles A.The F1F0-ATPase of Bifidobacterium animalis is involved in bile tolerance[J].Environmental microbiology,2006,8(10):1825-1833

[38]Ongol M P,Sawatari Y,Ebina Y,et al.Yoghurt fermented by Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus H+-ATPase-defective mutants exhibits enhanced viability of Bifidobacterium breve during storage[J].International Journal of Food Microbiology,2007,116(3):358-366

[39]An H,Zhou H,Huang Y,et al.High-level expression of hemedependent catalase gene katA from Lactobacillus sakei protects Lactobacillusrhamnosus from oxidative stress[J].Molecular biotechnology,2010,45(2):155-160

[40]Fu R Y,Bongers R S,Van Swam I I,et al.Introducing glutathione biosynthetic capability into Lactococcus lactis subsp.cremoris NZ9000 improves the oxidative-stress resistance of the host[J].Metabolic engineering,2006,8(6):662-671

[41]Tsai Y T,Cheng P C,Fan C K,et al.Time-dependent persistence of enhanced immune response by a potential probiotic strain Lactobacillus paracasei subsp.paracasei NTU 101[J].International Journal of Food Microbiology,2008,128(2):219-225

[42]Vinderola G,Perdigon G,Duarte J,et al.Effects of kefir fractions on innate immunity[J].Immunobiology,2006,211(3):149-156