基因工程改造與中國倉鼠卵巢細胞凋亡

張存超，寇 庚，3，王 皓，3

（1.上海張江生物技術(shù)有限公司，上海201203；2.抗體藥物與靶向治療國家重點實驗室，上海201203；3.第二軍醫(yī)大學(xué)腫瘤研究所，上海200433）

治療性單克隆抗體是生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展最迅速的領(lǐng)域，廣闊的市場需求對其大規(guī)模生產(chǎn)提出了巨大的挑戰(zhàn)。高效細胞株的高密度、長周期培養(yǎng)是提升抗體表達水平的重要手段，而長周期培養(yǎng)過程中，細胞凋亡是限制細胞密度提升和培養(yǎng)周期延長的關(guān)鍵因素［1］。細胞凋亡又稱細胞的程序性死亡，它是細胞在多種因素誘導(dǎo)下的自殺行為。

中國倉鼠卵巢（CHO）細胞是表達單克隆抗體最常用的工程細胞，抑制CHO細胞凋亡的途徑主要有細胞工程改造和培養(yǎng)基／培養(yǎng)條件優(yōu)化［2］。抑制CHO細胞凋亡的細胞工程改造是在細胞中上調(diào)或下調(diào)一個或多個基因的表達，從而達到抑制細胞凋亡的目的。

作者在此主要從細胞凋亡信號途徑、細胞信號通路以及小分子RNA（microRNA）等方面綜述了運用基因工程手段對CHO細胞凋亡改造的進展。

1 細胞凋亡信號途徑與凋亡

依起始半胱天冬酶（caspase）的不同，細胞凋亡途徑可分為外在途徑、內(nèi)在途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑［3］。外在途徑由細胞表面的死亡受體如Fas和腫瘤壞死因子受體家族引發(fā)；內(nèi)在途徑由應(yīng)激條件、化學(xué)治療試劑和藥物引發(fā)；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起caspase－12的活化，從而導(dǎo)致凋亡。

參與細胞凋亡信號途徑的基因分為兩種：抑制凋亡基因與促進凋亡基因，抑凋亡基因的過表達或促凋亡基因的下調(diào)均可抑制細胞凋亡。

bcl家族基因與凋亡密切相關(guān)。丁酸鈉能夠提高重組蛋白的表達量，同時也會抑制細胞增殖并且誘導(dǎo)凋亡。未添加丁酸鈉時，在CHO細胞中過表達bcl－2基因并不能抑制凋亡；然而，在添加5mmol·L－1丁酸鈉后，bcl－2過表達通過降低caspase－3的活性而抑制凋亡，進而延長培養(yǎng)時間2d以上，并且使得人源化抗乙肝表面S抗原抗體的表達量提高了3倍［4］。

Han等［5］使用Tet－off系統(tǒng)通過100ng·mL－1強力霉素控制bcl－xL的表達，在310mOsm·kg－1和480mOsm·kg－1滲透壓下，bcl－xL過表達在批次培養(yǎng)第8～10d通過降低剪切型caspase－7含量而抑制細胞凋亡。

Majors等［6］在CHO細胞中分別過表達了bcl家族基因mcl－1野生型基因及其不能被泛素蛋白酶降解的突變體mcl－1－5k，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者均能通過降低caspase－3活性而抑制細胞凋亡并分別提高VLA1抗體表達量40%和20%。

除了抑凋亡基因的過表達外，促凋亡基因的下調(diào)也能夠抑制凋亡。caspase－3是一種常見的促凋亡基因，在CHO細胞中借助反義RNA下調(diào)caspase－3表達量顯著抑制了5mmol·L－1丁酸鈉誘導(dǎo)的細胞凋亡，然而其抗體表達量并未提高［7］。

2 細胞信號通路與凋亡

細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是指信號分子經(jīng)細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)轉(zhuǎn)換，最終影響細胞生物學(xué)功能的過程。細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通過多種信號通路實現(xiàn)。PI3K／Akt／mTOR信號通路是細胞中與凋亡相關(guān)的重要通路。PI3K是細胞內(nèi)的一種磷脂酰肌醇3激酶，當(dāng)接受來自酪氨酸激酶和G蛋白偶聯(lián)受體的信號后，PI3K被激活并使Akt從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞膜上；并在3－磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1的輔助下，通過使Akt蛋白磷酸化而激活，并最終激活A(yù)kt底物雷帕霉素靶體蛋白（mTOR）［8］。

Akt和mTOR是PI3K／Akt／mTOR信號通路的核心蛋白。研究顯示，在CHO細胞中過表達人Akt可降低剪切型caspase－3蛋白含量，同時減輕染色體DNA片段化，這意味著Akt過表達抑制了CHO細胞凋亡［9］。與此類似，在CHO細胞中過表達人mTOR可提高培養(yǎng)基中血清缺乏（0.5%胎牛血清）或缺氧（1%氧濃度）時CHO細胞活率，并提高人胎盤堿性磷酸酶和α－淀粉酶的表達量3倍以上，表明mTOR可通過抑制凋亡提高細胞活率［10］。

3 小分子RNA（microRNA）與凋亡

microRNA是真核生物中廣泛存在、長度為21～23個核苷酸、可調(diào)節(jié)其它基因表達的RNA分子。研究發(fā)現(xiàn)，microRNA可通過與RNA或其它分子作用抑制細胞凋亡［11］。

一些研究者通過靶向特定的microRNA顯著抑制了細胞的凋亡。在CHO細胞中借助短發(fā)夾RNA（shRNA）穩(wěn)定敲除mmu－miR－466h－5p，與對照相比，基因敲除后的細胞活率顯著提高并延長培養(yǎng)時間35h以上，研究顯示caspase－3和caspase－7的激活被延遲并促進了抑凋亡基因bcl 2l 2等的表達，而且此細胞的表達產(chǎn)物人胎盤堿性磷酸酶的表達量提高了43%［12］。microRNA－326通過降低丙酮酸激酶活性、上調(diào)caspase－3和caspase－7，促進人膠質(zhì)瘤細胞的凋亡，通過特異性作用于microRNA－326或許可以抑制細胞凋亡［13］。除此之外，microRNA－133也是潛在的可用于抑制細胞凋亡的靶點［14］。

4 多基因協(xié)同作用與凋亡

在上述研究中，均是過表達單基因以抑制凋亡，此外，多基因常常被聯(lián)合使用以進一步抑制凋亡。與單基因在CHO細胞中過表達相比，beclin－1和bcl－2在CHO細胞中共表達進一步降低了剪切型caspase－3和caspase－7的蛋白含量，并抑制了3mmol·L－1丁酸鈉或0.1mol·L－1氯化鈉誘導(dǎo)的凋亡［15］。與之類似，多基因的聯(lián)合使用均取得了比單基因過表達更好的效果：如使用蛻皮激素誘導(dǎo)表達系統(tǒng)在CHO細胞中過表達抑凋亡基因E1B－19K和Aven顯著抑制了CHO細胞的凋亡并提高單克隆抗體表達量40%以上［16］、bcl－2和酮戊二酸轉(zhuǎn)運子過表達提高細胞對線粒體氧化損傷的耐受并抑制CHO細胞凋亡［17］、LDH－α敲除及bcl－2擴增通過作用于caspase－7來抑制二氫葉酸還原酶缺陷的CHO－DG44宿主細胞的凋亡［18］。與單基因過表達相比，熱休克蛋白HSP 27和HSP 70在CHO細胞中過表達進一步抑制了細胞凋亡，并提高了干擾素γ的表達量54%以上［19］。在CHO細胞中共表達存活素和細胞周期蛋白D1在無血清培養(yǎng)基中抑制了33%～43%的早期凋亡［20］。

5 潛在抑制細胞凋亡的基因

細胞代謝可能也與凋亡相關(guān)。代謝副產(chǎn)物乳酸的累積抑制細胞生長甚至降低產(chǎn)物表達量［21］。由此推測，減少乳酸的產(chǎn)生或許可以抑制細胞凋亡。比如，過表達丙酮酸羧化酶或敲除LDH－α均可改善細胞中的糖酵解代謝并減少乳酸產(chǎn)生，這或許也可以抑制細胞凋亡。

蘋果酸－天冬氨酸穿梭途徑相關(guān)蛋白可能與凋亡相關(guān)。以Aralar1蛋白為例，Aralar1在胰島β細胞中過表達可降低乳酸產(chǎn)生、改善線粒體能量代謝狀態(tài)［22］，而乳酸是糖酵解的常見代謝副產(chǎn)物，可誘導(dǎo)細胞凋亡；線粒體膜電位的改變是凋亡早期的顯著變化，由此推測Aralar1或許與凋亡相關(guān)。

此外，牛磺酸轉(zhuǎn)運子在CHO細胞中過表達可提高細胞活率、減少乳酸產(chǎn)生并提高重組蛋白表達量，是另一個潛在的細胞工程靶點［23］。

從與凋亡相關(guān)的信號通路出發(fā)，對CHO細胞進行調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的基因工程改造可能帶來更好的效果。除了上面提到的PI3K／Akt／mTOR通路外，Hippo－Mst信號通路或許可以作為潛在靶點。在果蠅中，hippo抑制細胞增殖、促進細胞凋亡，被認為是抑癌基因。下調(diào)Hippo－Mst信號途徑的關(guān)鍵蛋白表達可能加速細胞增殖并抑制細胞凋亡［24］。Akt通路的調(diào)控或許也能抑制細胞凋亡。PHLDA3是p53調(diào)節(jié)的Akt抑制基因，Akt的過表達抑制了細胞凋亡，以此推測PHL－

DA3的下調(diào)或許是抑制凋亡的另一個途徑［25］。

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