生物與胞外聚合物偶聯降解石油污染土壤中常見有機物*

楊智臨 李亞龍 白智勇 王士東 楊琦

中國地質大學（北京）水資源與環境學院

生物與胞外聚合物偶聯降解石油污染土壤中常見有機物*

楊智臨 李亞龍 白智勇 王士東 楊琦

中國地質大學（北京）水資源與環境學院

將石油污染土壤中篩選出來的專一性降解萘菌株Rhodococcus、專一性降解菲菌株Nocardioides與胞外聚合物（EPS）聯用，對石油污染土壤中常見的兩種難降解有機物萘、菲的降解規律和動力學與菌株的生長曲線進行研究。實驗結果表明，EPS與萘降解菌聯用吸附降解萘的最佳萘初始投加量為2.14mg/L，最佳pH值為6，最佳溫度為30℃；EPS與菲降解菌聯用吸附降解菲的最佳菲初始投加量為0.06mg/L，最佳pH值為6，最佳降解溫度為20℃。EPS與菌株聯用對萘的去除率達96%時，菲的去除率達100%。

石油；胞外聚合物；萘、菲；降解

將石油污染土壤中篩選出來的專一性降解萘菌株Rhodococcus、專一性降解菲菌株Nocardioides與胞外聚合物（EPS）聯用，對石油污染土壤中常見的兩種難降解有機物萘、菲的降解規律和動力學與菌株的生長曲線進行研究。

1 實驗與方法

1.1 試驗試劑與儀器

儀器：立式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋（LDZX—40CI，上海申安）、恒溫水浴振蕩器（SHA—B，國華）、分析天平（FA1004，上海精科）、分光光度計（722s，上海精密科學儀器）、高速冷凍離心機（GL—20M，上海盧湘）、液相色譜儀（1525，Waters）等。

材料試劑：萘（育才精細化工）、菲（J&KCHEMICA）、牛肉膏、蛋白胨（均為奧博星）、無機鹽等，無機鹽及微量元素配比成分參見文獻[1]。本實驗所用藥劑均為分析純。

1.2 萘、菲的測定

以高效液相色譜定量測定萘、菲濃度，色譜柱為C—18反相色譜柱，紫外檢測波長254nm，流動相為甲醇∶水=90∶10，流速為1.0mL/min。

1.3 EPS的提取

為了避免化學藥劑對EPS性質的影響，采用物理方法提取EPS。本文選用蒸汽法，將活性污泥試樣置于高壓滅菌鍋中，在120℃，100kPa的條件下加熱10min左右，然后以9000r/min的轉速離心15min，上清液用濾膜過濾，得粗EPS[2]后以0.45μm濾膜過濾，再放入4℃冰箱保存備用。

1.4 降解實驗

250mL血清瓶中含有定量萘或菲、2mL菌懸液、2mL的EPS，并且加入216mL無機鹽，使液體體積達到220mL。密封瓶口后放入恒溫水浴搖床中開始實驗。取樣時刻為0、0.5、2、4、8、12和24h。

2 結果與討論

2.1 菌對萘、菲的降解

（1）EPS與萘降解菌耦合降解萘。初始條件：EPS的投加量為42mg/L，萘的初始濃度為6mg/L，pH值為7，菌懸液接種量為1%，轉速為150r/min。以時間（t）為橫坐標，初始濃度/當前時刻濃度（c/c0）為縱坐標做圖，在不同溫度條件下菌種對萘的降解如圖1所示。從圖1可以看出，在反應開始12h內，30℃和35℃條件下的降解速率明顯要高于20℃和25℃。其原因可能是在反應開始時，隨著溫度的升高，酶的活性較高[3]，因此，反應隨著溫度的升高開始；在30℃條件下，EPS與萘降解菌耦合對萘的去除率最高為75%。

（2）EPS與菲降解菌耦合降解菲。初始條件：EPS的投加量為42mg/L，菲的初始濃度為0.5mg/L，pH值為7，菌懸液接種量為1%，轉速為150r/min。以時間（t）為橫坐標，初始濃度/當前時刻濃度（c/c0）為縱坐標做圖，在不同溫度條件下菌種對菲的降解如圖2所示。從圖2可以看出，隨著溫度的降低，對菲的去除率逐漸上升，即EPS與菲降解菌聯用去除菲的效果隨著溫度的升高逐漸降低；同時，在12h后，吸附量基本上不再變化，類似于達到了一種吸附平衡，這說明在降解過程中，EPS的吸附作用占據主導作用。

圖1 EPS與萘降解菌耦合在不同溫度條件下降解吸附萘

圖2 EPS與菲降解菌耦合在不同溫度條件下降解吸附菲

2.2 動力學研究

對EPS與菌株偶聯降解萘分別進行一級動力學與二級動力學模擬。由模擬結果可知，對于不同溫度下EPS與菌株偶聯使用降解吸附萘的動力學模擬更加符合一級動力學方程，其R2值均在0.95左右；在20、25、30、35℃的情況下，反應速率常數k分別為0.025、0.0045、0.056、0.045，半衰期t1/2分別為27.7260、15.4033、12.3776、15.4033。

2.3 菌種的生長曲線

準備2個錐形瓶，向錐形瓶內分別接種1%的萘降解菌株和菲降解菌株，然后分別向2個錐形瓶中投加足夠量萘菲來提供碳源，并且分別加入2mL的EPS，在30℃，150r/min搖床上培養[4]，定時對菌株的生長進行檢測，利用OD600來表征菌量的多少。從圖3、圖4可以看出，兩株菌生長均都有明顯的對數增殖期（減速增殖期）、穩定期、內源呼吸期。另外，對于萘菌來講，對數增殖期明顯減少，在7天時細菌數量就開始趨向穩定，這說明EPS對于萘菌的生長有促進作用。這可能是由于EPS中大量的蛋白質和多糖等成分對萘菌起了共代謝的作用，使細菌的代謝速度增加，從而使細菌數量迅速達到飽和值。兩種菌株基本上也都是在60天后衰減到了一定的值，細菌數量趨于穩定。

圖3 EPS與萘共同作為碳源降解萘菌生長曲線

圖4 EPS與菲共同作為碳源降解菲菌生長曲線

3 結論

（1）EPS與萘降解菌聯用吸附降解萘的最佳萘初始投加量為2.14mg/L，最佳pH值為6，最佳溫度為30℃；EPS與菲降解菌聯用吸附降解菲的最佳菲初始投加量為0.06mg/L，最佳pH值為6，最佳降解溫度為20℃。

（2）在本實驗范圍內，EPS與萘降解菌以及菲降解菌聯用吸附降解萘的最高去除率為96%，對菲最佳去除率為100%。

（3）在萘、菲互相共代謝條件下，兩種菌株的生長都有明顯的對數增殖期（減速增殖期）、穩定期、內源呼吸期。

[1]王士東，楊琦，王詩宗，等．好氧污泥胞外聚合物提取方法比較及其對染色劑玫瑰紅B的吸附[J]．安全與環境學報，2014，14（1）：172-176.

[2]曾艷，張明青．活性污泥胞外聚合物提取方法及其絮凝性能研究[J]．化工環保，2011，31（1）：87.

[3]張帆．污染土壤中萘、菲降解菌的篩選鑒定及降解特性研究[D]．北京：中國地質大學（北京），2013.

[4]白智勇，李博，楊琦．兩株菌對萘的降解特性對比[J]．油氣田地面工程，2013，32（3）：48-49.

（欄目主持 楊軍）

10.3969/j.issn.1006-6896.2014.12.007

基金論文：重點防控重金屬汞、鉻、鉛、鎘、砷便攜/車載/在線監測儀器開發與應用示范（2012YQ060115）；中央高校基本科研業務費專項資金資助（2652013101,2652013086,2652013087）。