多倍體技術(shù)在魚類育種中的應(yīng)用

李同明 孟令杰 季相山 王慧

特種動物

多倍體技術(shù)在魚類育種中的應(yīng)用

李同明①孟令杰②季相山①王慧①

（①山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 山東 泰安 271018 ②山東省定陶縣孟海鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心）

1 人工誘導(dǎo)多倍體的方法

人工誘導(dǎo)多倍體的方法主要有：物理學(xué)方法、化學(xué)方法和生物學(xué)方法。物理學(xué)方法與生物學(xué)方法安全無害，應(yīng)用較多。

1.1 物理學(xué)方法 （1）物理學(xué)方法主要有靜水壓法、溫度休克法和電休克法等。應(yīng)用較多的是溫度休克法和靜水壓法；也可以將不同的方法相結(jié)合，以提高人工誘導(dǎo)多倍體的效率。（2）靜水壓法是通過水壓機產(chǎn)生的靜水壓來抑制第二極體的釋放或抑制第一次卵裂，而使染色體倍數(shù)增加。其技術(shù)操作規(guī)程較為簡單，條件易于優(yōu)化和掌握，處理程序也易于標(biāo)準(zhǔn)化。因而，靜水壓法在魚類的多倍體育種中有較多應(yīng)用。其主要優(yōu)點在于：誘導(dǎo)率較高，可達90%以上。處理時間短，一般為3~5min。對受精卵的損傷小，成活率高。（3）溫度休克法包括冷休克和熱休克兩種截然不同的方法，其應(yīng)用也較為廣泛。冷休克法是指受精卵置于0~5℃(略低于其致死溫度)的低溫條件下幾分鐘，使其休克，以抑制第二極體的釋放或抑制第一次卵裂，處理片刻后，立即恢復(fù)生存溫度，可誘導(dǎo)出三倍體或四倍體的魚；而熱休克法則是將受精卵置于30℃(略高于其致死溫度)的較高溫度下，也可誘導(dǎo)出三倍體或四倍體的魚。影響溫度休克法誘導(dǎo)多倍體效果的關(guān)鍵因素有：處理的時機、持續(xù)時間和溫度的高低。受精后立刻進行溫度休克，可阻止第二極體的排出；若是在第一次有絲分裂的中期進行休克處理，可抑制第一次卵裂。（4）電休克法是通過電激使細胞融合而使染色體數(shù)倍增的技術(shù)，賈方鈞(2001年)試驗發(fā)現(xiàn)，受精卵分別在非電解質(zhì)的甘露糖溶液和電解質(zhì)的含5%小牛血清的細胞培養(yǎng)液中接受電激，細胞的融合效率差別不大，但融合后胚胎發(fā)育成活率有明顯差別，細胞在非電解質(zhì)溶液中接受點激的損傷較小，得到的多倍體后代成活率較高。不同魚類受精卵接受電激的時機和時間不同，需要進行對比試驗。（5）熱休克與電休克方法相結(jié)合在誘導(dǎo)銀大麻哈魚三倍體中獲得了成功，試驗還發(fā)現(xiàn)，交流電誘導(dǎo)三倍體比直流電更有效，將受精40min的卵置于26℃并給以10min的10V交流電休克處理，可得到100%的三倍體虹鱒魚。

1.2 化學(xué)方法 應(yīng)用一些化學(xué)藥品，選擇適當(dāng)?shù)臅r機處理魚類的受精卵，可有效地抑制第二極體的排出或抑制第一次有絲分裂，產(chǎn)生三倍體或四倍體魚。其原理是：細胞松馳素B等化學(xué)藥品可抑制紡錘絲內(nèi)微管的形成，因而，可以干擾減數(shù)分裂或有絲分裂中紡錘體的正常收縮，使細胞分裂受阻，染色體加倍。常用于誘導(dǎo)多倍體的化學(xué)試劑還有：聚乙二醇(PEG)、6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)、秋水仙素、咖啡因和N2O等。

1.3 生物學(xué)方法 （1）人工誘導(dǎo)多倍體的生物學(xué)方法主要有遠緣雜交、核移植和細胞融合等。應(yīng)用較多的是遠緣雜交法。（2）遠緣雜交主要是借助于異源精子的不親和性而誘發(fā)染色體倍數(shù)增加，產(chǎn)生多倍體。遠緣雜交技術(shù)易操作，應(yīng)用較為廣泛。鯉科不同亞種之間的遠緣雜交，往往會可以產(chǎn)生多倍體。鳙(♂)×草魚(♀)雜交會產(chǎn)生三倍體雜種魚。草魚、鳙及其F1的染色體組型分析結(jié)果是：草魚與鳙具有二倍的染色體數(shù)(2n=48)，而F1全部具有三倍染色體數(shù)(3n=72)。鳙(♂)×草魚(♀)雜交時，會同時出現(xiàn)二倍體雜種與三倍體雜種，但在二倍體的雜種中有35.1%的為畸形；而三倍體的雜種中僅5.1%為畸形。將草魚(♂)與興國紅鯉(♀)進行遠緣雜交，獲得了異源四倍體雜種魚。在三角魴(♂)×草魚(♀)的遠緣雜交中獲得了異源三倍體雜種，其中，草魚提供了2個染色體組；而三角魴只供了一個染色體組。（3）核移植是將供體細胞核轉(zhuǎn)移或嵌入到去核的卵母細胞中，使后者不經(jīng)精子穿透等有性過程而被激活和進入細胞分裂和胚胎發(fā)育的過程中，這種方法可使核供體的基因得到完全復(fù)制。用四倍化的草魚體外培養(yǎng)的細胞作為核供體，移植到泥鰍的去核卵內(nèi)，獲得發(fā)育到心跳期的四倍體胚胎。（4）核移植技術(shù)需要顯微操作，難度較大，在實驗室中有較多的應(yīng)用，但在育種實踐中的應(yīng)用常受到限制。（5）細胞融合誘導(dǎo)多倍體的技術(shù)，是在人工誘導(dǎo)下，將兩個不同基因型的細胞融合成一個雜種細胞的方法。該方法包括誘導(dǎo)囊胚細胞與囊胚細胞、囊胚細胞與未受精卵、囊胚細胞與受精卵、受精卵與受精卵之間的細胞融合，但由于細胞內(nèi)染色體發(fā)生重排，實際得到的是各種不同數(shù)量染色體的細胞群。所以，細胞融合在多倍體育種中的應(yīng)用十分有限。（6）草魚囊胚細胞與團頭魴受精卵的電融合，在98個卵中有73個融合卵發(fā)育至原腸胚(79.49%)，65個發(fā)育至心跳期(66.33%)，49個發(fā)育至仔魚期(50%)，染色體計數(shù)在56~88之間，屬于嵌合體。利用這一技術(shù)可以用來研究魚類外源染色體對發(fā)育的影響和探索改良品種的可能性。

2 魚類多倍體育種研究和應(yīng)用現(xiàn)狀

（1）多倍體育種技術(shù)有許多優(yōu)越性，主要表現(xiàn)在：其一、能提高雜種后代的成活率，提高生長速度；其二，能控制性腺發(fā)育或性早熟，延長生長周期，顯著提高品質(zhì)、價格，顯著提高經(jīng)濟效益。另外，還可以控制多倍體魚類在自然水域環(huán)境中的自然繁殖，控制生物入侵現(xiàn)象。（2）許多研究發(fā)現(xiàn)，魚類在生長過程中，很容易受到環(huán)境雌激素等污染物的影響，而發(fā)生性早熟現(xiàn)象，這會顯著降低人工養(yǎng)殖魚類的商品價值，使其生長速度降低，死亡率提高，個體偏小，達不到商品規(guī)格，而且其肉質(zhì)和外觀都較差；而性腺不育的三倍體魚類，在耐水污染、耐寒和抗病性等抵抗惡劣環(huán)境方面具有明顯的優(yōu)勢，性腺不發(fā)育，顯著提高了其生長速度，明顯地改善了魚肉的品質(zhì)，多倍體不育的魚將性腺發(fā)育的能量全部集中在生長方面，自然會顯著提高餌料的轉(zhuǎn)化系數(shù)，獲得較高產(chǎn)量和品質(zhì)。異源四倍體有可能解決遠緣雜交不育的問題；而三倍體育種對于控制一些魚類的過度繁殖、防止基因混雜、改良種質(zhì)資源和培育新品種具有獨特的作用。所以，在魚類人工誘導(dǎo)多倍體的研究中，三倍體和異源四倍體最常見和應(yīng)用最為廣泛，且已取得了一些實效。（3）日本成功地應(yīng)用靜水壓法，大規(guī)模誘導(dǎo)生產(chǎn)出了馬蘇大馬哈魚全雌三倍體和牙鲆四倍體魚。俄羅斯成功地開展了工廠化大規(guī)模培育鯉魚三倍體的研究。（4）全雌三倍體虹鱒由于其不受性成熟影響而提高了商品規(guī)格，在加拿大已進行了商品化大規(guī)模生產(chǎn)；三倍體草魚在美國天然水域中放養(yǎng)，用于除草，并能阻止其大量繁殖而破壞生態(tài)平衡。（5）用低溫法成功地誘導(dǎo)了三棘刺魚得到了三倍體，并且飼養(yǎng)到性成熟。目前，已經(jīng)成功地獲得了人工誘導(dǎo)多倍體的魚類有30多種，分別為三棘刺魚、鰈魚、鯉魚、尼羅羅非魚、虹鱒魚、大西洋鮭、泥鰍、草魚、斑點叉尾鮰、鳙魚、鰱魚、白鯽等，有的已經(jīng)開始用于生產(chǎn)，并取得了較明顯的經(jīng)濟效益。（6）魚類的多倍體育種在應(yīng)用中也存在著許多不足和限制性因素，主要有誘導(dǎo)率還較低；多倍體魚卵的孵化率偏低；人工誘導(dǎo)條件需要完善，如溫度刺激時間、刺激強度、藥物濃度和作用時間、刺激的時機等都尚需進一步優(yōu)化；染色體倍數(shù)的鑒定方法需要建立。這些均需要進行更加深入的研究。

3 魚類多倍體育種的應(yīng)用前景

多倍體技術(shù)育種對于提高魚類的產(chǎn)量、加快其生長速度、延長其壽命、控制其過度繁殖、保護魚類種質(zhì)資源和合理開發(fā)利用漁業(yè)資源等，都有著十分重要的作用。雖然，目前魚類的多倍體育種還存在許多尚未解決的難題，但是，隨著多倍體研究的不斷深入和現(xiàn)代生物技術(shù)的迅速發(fā)展，魚類多倍體育種技術(shù)將會不斷地走向成熟，為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展作出更大貢獻。

（2014–05–14）

S961.6

A

1007-1733(2014)08-0075-02