肺巨細胞癌細胞與支氣管上皮細胞分泌蛋白質(zhì)的差異分析

李雪華，谷彥軍，劉 靜，劉燕青

(1武警后勤學院附屬醫(yī)院，天津300162;2天津市職業(yè)與環(huán)境危害防制重點實驗室)

肺癌的早期診斷至關重要，至今未找到能夠早期較好地發(fā)現(xiàn)肺癌的檢測方法［1，2］。近年來，蛋白質(zhì)組學的研究為肺癌診斷標志物的發(fā)現(xiàn)提供了新的思路，故尋找肺癌相關蛋白質(zhì)，進一步確立肺癌早期診斷標志物，是目前亟需解決的問題。2011年4月～2014年3月，我們觀察了肺巨細胞癌細胞株和支氣管上皮細胞株分泌蛋白質(zhì)的差異，為進一步確定肺癌早期診斷相關蛋白標志物奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 肺巨細胞癌細胞株95C和支氣管上皮細胞株16HBE購自中國醫(yī)學科學院腫瘤細胞庫。等電聚焦儀(Protean IEF cell)、垂直電泳系統(tǒng)(proteanⅡxi cell)均購自Bio-Rad公司。固相pH梯度干膠條(pH 4～7，17 cm)、IEF buffer(pH 3～10)為 Bio-Rad公司產(chǎn)品;碘乙酰銨、尿素、二硫蘇糖醇(DTT)等均為Sigma公司產(chǎn)品;1640培養(yǎng)基、胎牛血清為Gibco公司產(chǎn)品。圖像分析軟件為PDQuest8.0。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 肺巨細胞癌細胞株95C和支氣管上皮細胞株16HBE用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基于37℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。待細胞長滿培養(yǎng)瓶，棄去培養(yǎng)基，PBS沖洗5次，加入無血清培養(yǎng)基再培養(yǎng)24 h，收集上清液，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 雙向電泳(2-DE)2-DE方法參照儀器操作手冊和文獻［3～5］進行。200 μg 蛋白質(zhì)與上樣緩沖液充分混合，總體積為500 μL，上樣，固相pH梯度干膠條重水化16 h后等電聚焦電泳。電泳完畢，將膠條立即在平衡液A(6 mol/L尿素、2%十二烷基硫酸鈉、pH 8.8、0.05 mol/L Tris-HCL、20% 甘油、2%DTT)中平衡15 min，再于平衡液B(以2.5%碘乙酰胺替換平衡液A中2%DTT)中平衡15 min。平衡后進行垂直板SDS-PAGE電泳。然后將2-DE所得凝膠按文獻［6～8］進行硝酸銀染色。用透射掃描儀掃描染色后的2-DE凝膠。

1.2.3 凝膠圖像分析 用PDQuest8.0軟件分析掃描后的凝膠圖像。比較兩細胞株分泌蛋白質(zhì)的2-DE圖譜，尋找差異蛋白質(zhì)點。蛋白的相對表達量升高3倍或者降低2/3為差異點。

2 結(jié)果

2.1 分泌蛋白質(zhì)2-DE圖譜建立 能夠獲得比較穩(wěn)定的兩細胞株分泌蛋白質(zhì)的2-DE圖譜，平均蛋白質(zhì)點約200個。

2.2 分泌蛋白質(zhì)2-DE圖譜差異分析 軟件分析顯示，兩細胞株共發(fā)現(xiàn)差異蛋白質(zhì)點7個，肺巨細胞癌細胞株特有的差異點4個，量下調(diào)的差異點3個。

3 討論

目前，肺癌的診斷主要通過影像學檢查、纖維支氣管鏡及活體組織檢查，早期確診率不高，常常在確診時已達晚期，失去早期治療的機會。因此，尋找新的肺癌標志物是目前亟待解決的問題。

近年來，腫瘤蛋白質(zhì)組學為肺癌的早期診斷研究提供了新思路。蛋白質(zhì)組學是以蛋白質(zhì)組為研究對象，應用相關研究技術，從整體水平上來認識蛋白質(zhì)的存在及活動方式［9～11］。2-DE和質(zhì)譜是蛋白質(zhì)組學研究的核心技術［12］。腫瘤蛋白質(zhì)組學主要運用蛋白質(zhì)組學相關技術發(fā)現(xiàn)腫瘤相關蛋白質(zhì)，繼而研究其特性、結(jié)構(gòu)和功能。

腫瘤在發(fā)生、發(fā)展過程中會分泌蛋白質(zhì)進入血液。理論上，血清中肺癌細胞分泌的蛋白質(zhì)的出現(xiàn)會早于X線上可見腫塊的形成。因此，肺癌細胞分泌的特異性蛋白質(zhì)不但可以作為潛在的肺癌診斷標志物，而且對肺癌的早期篩選具有重要意義。

本研究比較了肺巨細胞癌細胞株95C和支氣管上皮細胞株16HBE分泌的蛋白質(zhì)差異，尋找肺癌相關特異性蛋白質(zhì)。在前期建立了穩(wěn)定性、重復性較好的蛋白質(zhì)2-DE技術基礎上［13］，利用2-DE分離分泌的蛋白質(zhì);建立了兩細胞株分泌蛋白質(zhì)2-DE圖譜;通過PDQuest8.0軟件尋找差異蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)肺巨細胞癌特有的差異蛋白質(zhì)點4個，量下調(diào)的蛋白質(zhì)點3個。肺癌特有的蛋白質(zhì)是癌細胞分泌、釋放的，可能與腫瘤的發(fā)生、生長或轉(zhuǎn)移密切相關;而量下調(diào)的蛋白質(zhì)有可能是一些抑癌基因作用的結(jié)果或者是一些對腫瘤生長或轉(zhuǎn)移起到調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)。

總之，篩選出的這些差異蛋白質(zhì)可能是肺癌發(fā)病或病程進展的重要相關蛋白質(zhì)，對肺癌的早期篩選具有重要意義，有可能作為肺癌早期診斷的血清標志蛋白質(zhì)。

［1］和平，李少民，朱雯瑾.蛋白質(zhì)組學方法篩選肺腺癌相關蛋白［J］.西安交通大學學報(醫(yī)學版)，2013，34(6):803-806.

［2］Maciel CM，Junqueira M，Paschoal ME，et al.Differential proteomic serum pattern of low molecular weight proteins expressed by adenocarcinoma lung cancer patients ［J］.J Exp Ther Oncol，2005，5(1):31-38.

［3］Li J，Zhang Z，Rosenzweig J，et al.Proteomics and bioinformatics approaches for identification of serum biomarkers to detect breast cancer［J］.Clin Chem，2002，48(8):1296-1304.

［4］G?rg A，Obermaier C，Boguth G，et al.The current state of twodimensional electrophoresis with immobilized pH gradients［J］.E-lectrophoresis，2000，21(6):1037-1053.

［5］Curreem SO，Watt RM，Lau SK，et al.Two-dimensional gel electrophoresis in bacterial proteomics［J］.Protein Cell，2012，3(5):346-363.

［6］Mortz E，Krogh TN，Vorum H，et al.Improved silver staining protocols for high sensitivity protein identification using matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight analysis［J］.Proteomics，2001，1(11):1359-1363.

［7］Wu RW，Wang FS，Ko JY，et al.Comparative serum proteome expression of osteonecrosis of the femoral head in adults［J］.Bone，2008，43(3):561-566.

［8］Yu J，Liu F，Cui SJ，et al.Vitreous proteomic analysis of proliferative vitreoretinopathy［J］.Proteomics，2008，8(17):3667-3678.

［9］Jorgensen LG，Osterlind K，Genolla J，et al.Serum neuron-specific enolase(S-NSE)and the prognosis in small-cell lung cancer:a combined multivariable analysis on data from nine centers［J］.Br J Cancer，1996，74(3):463-467.

［10］Kulpa J，Wojcik E，Reinfuss M，et al.Carcinoembryonic antigen，squamous cell carcinoma antigen，CYFRA21-1，and neuron specific enolase in squamous cell lung cancer patients［J］.Clin Chem，2002，48(11):1931-1937.

［11］Chambers G，Lawrie L，Cash P，et al.Proteomics:a new approach to the study of disease［J］.J Pathol，2000，192(3):280-288.

［12］Aebersold R，Mann M.Mass spectrometry-based proteomics［J］.Nature，2003，422(6928):198-207.

［13］李雪華，李欣，丁彥青.血清蛋白質(zhì)組雙向凝膠電泳技術的建立［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志，2004，14(11):95-96.