鰱魚致病性嗜水氣單胞菌的分離與鑒定

萬玉華 彭章華 楊 軍 汪 勇 彭明珍

(1.瀘縣牛灘鎮畜牧獸醫站,四川瀘縣 646105; 2.瀘縣畜牧局,四川瀘縣 646100)

鰱魚致病性嗜水氣單胞菌的分離與鑒定

萬玉華1*彭章華2楊 軍2汪 勇2彭明珍2

(1.瀘縣牛灘鎮畜牧獸醫站,四川瀘縣 646105; 2.瀘縣畜牧局,四川瀘縣 646100)

目的:利用實驗室診斷技術對某鰱魚養殖廠發病鰱魚進行診斷,以期為該場發病鰱魚的治療和預防提供技術支持。方法:運用細菌分離培養、生化鑒定對該發病養殖場隨機挑取發病鰱魚進行診斷,利用藥敏試驗進行治療藥物的篩選。結果:從鰱魚中分離菌株19株,其中13株為嗜水氣單胞菌菌株,檢出率為65.4%。藥敏試驗結果篩選出的藥物為該病治療和預防提供了參考依據。

鰱魚;致病性嗜水氣單胞菌;分離;鑒定

1 材料

1.1 病料來源

隨機選取15條來自發病養殖場的鰱魚。

1.2 主要試劑及儀器

普通培養基、AHM鑒別培養基、脫脂奶蔗糖蛋白胨平板、氧化酶試劑、H2O2酶試劑；DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒；2×Taq PCR Master Mix；VitekGNI+鑒定卡片。顯微鏡，生化培養箱。

1.3 試驗動物

15～18g健康小白鼠20只。

2 方法

2.1 細菌分離和初步鑒定

將抽取發病鰱魚處死，無菌操作采集其肝臟、脾臟、心血等組織，劃線接種于營養瓊脂平板28℃培養18～24h。挑取典型菌落純化培養，革蘭染色鏡檢觀察細菌形態，并用純化菌落進行氧化酶、過氧化物酶試驗。

2.2 培養特性試驗

2.2.1 AHM培養基鑒定

將純菌落接種于AHM培養基，28℃過夜培養，觀察顏色反應，并作穿刺培養，觀察運動情況。

2.2.2 主要毒力因子試驗

將純菌接種于脫脂奶蔗糖蛋白胨平板28℃培養過夜，觀察脫脂奶平板上菌落周圍是否出現清晰透明的溶蛋白圈，以確定菌體是否產生胞外蛋白酶。

2.3 生化鑒定

采用微量發酵管法檢測分離菌株生化特性，28℃恒溫培養7d，測定包括糖發酵試驗、氨基酸代謝試驗、細菌酶試驗、耐鹽試驗等

2.4 人工感染試驗

將鑒定為嗜水氣單胞菌的分離株進行純培養低速低溫離心后，用無菌生理鹽水懸浮至原體積進行小鼠感染試驗。小鼠共分成4組，分別為對照組和試驗1～4組（5只/組），對照組腹腔接種無菌生理鹽水0.2ml，試驗1～3組分別腹腔接種0.2 ml，1組接種濃度為3×104cfu/ml，2組接種為3×105cfu/ml，3組接種濃度為3×106cfu/ml。感染小鼠后，觀察24h內發病情況，死亡小鼠立即剖解。24 h后，處死所有小鼠，無菌操作觀察其主要的病理剖解變化并分離目的菌，培養并鑒定。

2.5 藥敏試驗

選取16種藥敏紙片，分別檢測抑菌圈直徑，參照抗菌藥物敏感試驗標準確定各種藥物對病原菌株的敏感性。

3 結果與分析

3.1 病原菌的分離

分離該疑似嗜水氣單胞菌菌落邊緣整齊、光滑、微凸，呈無色或淡黃色。顯微鏡下觀察為兩端圓形，至球菌狀，單個、成對或成鏈排列，直徑1.0～4.4μm的革蘭氏陰性短桿菌；以極生鞭毛運動，一般單鞭毛。分離株分別命名為L1-L19進行后續試驗。

3.2 氧化酶試驗

19株純化菌在營養瓊脂平板培養基28℃過夜培養后，氧化酶試驗結果表明：絕大部分菌株氧化酶試驗為陽性。

3.3 AHM鑒別培養基

實驗結果為：頂部為紫色，底部為淡黃色；細菌沿穿刺線呈刷狀生長，即運動力陽性，部分菌株頂部黑色，少數產有氣泡。

3.4 主要毒力因子檢測結果

10 g/L脫脂奶蔗糖胰蛋白胨平板上菌落周圍出現清晰透明的溶蛋白圈。

3.5 生化鑒定結果

分離的19株菌株經過生化鑒定，其中14株生化鑒定結果與嗜水氣單胞菌生化特性相近。

3.6 DNA擴增序列測定于分析

對分離出的各株純培養分細菌進行PCR反應，測序結果，序列分析表明其中13株菌為嗜水氣單胞菌。

3.7 動物試驗

試驗組1～3小白鼠接種后，2、3組小鼠均在24h內死亡，1組死亡2只，另外3只小鼠表現為弓背、聳毛、運動遲緩、食欲不振，雙眼半閉、呼吸急促等癥狀。24后處死所有小鼠，無菌操作解剖死亡及處死小鼠，試驗組小鼠分離出目的菌，對照組小鼠24 h無不良反應，未分離出目的菌。

3.8 藥敏試驗

藥敏試驗結果表明。分離菌株對頭孢三嗪、頭孢哌酮鈉、四環素、卡那霉素、慶大霉素、環丙沙星、諾氟沙星、呋喃唑酮敏感，對新生霉素、麥迪霉素、鏈霉素、利福平、紅霉素、林可霉素、頭孢拉定、氨芐西林鈉不敏感。

4 討論

（1）從鰱魚中分離的病原菌，觀察其在營養瓊脂培養基上生長菌落形態及其在1%脫脂奶蔗糖胰蛋白胨平板上培養菌落周圍出現清晰的透明溶蛋白圈，AHM鑒別培養基上陽性表現頂部仍為紫色，底部為淡黃色；細菌沿穿刺線呈刷狀生長部分菌株頂部黑色都與嗜水氣單胞菌相符。對生化鑒定為嗜水氣單胞菌的分離菌株進行PCR擴增測序比對，表明分離菌與嗜水氣單胞菌同屬一個類群。胞外蛋白酶是嗜水氣單胞菌與其毒素的分泌有密切的關系，因而對胞外蛋白酶的檢測也作為嗜水氣單胞菌鑒定的重要方面。試驗中總共從鰱魚中分離菌株19株，其中為嗜水氣單胞菌的菌株為13株，檢出率68.4 %。對分離的菌株做人工感染試驗，

（2）通過藥敏試驗篩選出頭孢三嗪、頭孢哌酮鈉、四環素、卡那霉素、慶大霉素、環丙沙星、諾氟沙星、呋喃唑酮對該致病性嗜水氣單胞菌具有良好的抑制作用，在該鰱魚養殖場在治療本病的時可起到指導作用。

（3）對于本病最根本的方法還是預防為主，防治結合。養殖場需加強飼養管理，保證良好的水質、適宜的養殖密度，在夏季時注意水溫的控制，清塘時徹底消毒。同時要加強平時對養殖鰱魚應隨時注意觀察，做到早發現，早治療。發病后，對未被感染的池子嚴格進行隔離，對發病鰱魚若存在治療價值進行積極救治，若治療價值不大，及時進行淘汰處理，并對魚塘進行清塘消毒。

[1] 梁婷，丁建華，馮佳，等.鰱魚對浮游植物濾食的選擇吸收[J].當代水產，2014，（1）：73-74.

[2] 張舵，蔡懋沅，王柏錚，等.白鰱的養生價值探討[J].安徽農業科學，2013，41（12）：5381-5383.

[3] 沈錦玉.嗜水氣單胞菌的研究進展[J].浙江海洋學院學報（自然科學版），2008，27（1）：78-86.

萬玉華（1972-），女，大學本科，長期從事動物疾病診療。