牛源大腸桿菌O157∶H7的分離鑒定及其生物學特性研究

程慧芳，寇亞楠，陳雅君，劉中原，張龍現,2，王亞賓，陳麗穎，胡 慧,2

腸出血性大腸桿菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli) O157∶H7是一種重要的人獸共患傳染病病原菌。感染該菌可使人患腹瀉、出血性結腸炎(hemorrhagic colitis，HC)，此外還可引發溶血性尿毒綜合征(hemolytic uremic syndrome，HUS)及血栓性血小板減少性紫癜(thrombotic thrombocytopenic purpura，TTP)等并發癥，嚴重者可導致死亡，致死率達5%～10%[1-2]。

自1982年美國首次暴發了由大腸桿菌O157∶H7引起的出血性腸炎以來，加拿大、英國、日本等國也相繼報道了大腸桿菌O157∶H7的爆發和流行[3]；我國也陸續有多個省份在食品、家禽、家畜、昆蟲、腹瀉病患者中檢出該致病菌[4-5]，腸出血性大腸桿菌O157∶H7的感染已經成為一個全球性的公共衛生問題。

大腸桿菌O157∶H7是一種以食物為主要傳播途徑的致病菌，牛、羊、豬和雞等家畜家禽是其主要宿主[3,6]，該菌感染后可從動物傳染給人，也可由人傳染給人而引起感染；同時也可以通過食物、水源而間接的傳染給人[7]。我國于1987年首次從出血性結腸炎病人糞便中分離到大腸桿菌O157∶H7，此后多個省也都陸續有報道從市售食品、進口食品、家畜家禽、腹瀉患者糞便中分離到該菌。因此，對動物源性大腸桿菌O157∶H7進行快速檢測方法的研究、流行病學調查、生物學特性研究以及遺傳變異研究就顯得尤為重要，是及時有效地防控大腸桿菌O157∶H7感染流行的關鍵步驟。

為了解大腸桿菌O157∶H7在牛群中的流行及其病原學特性，本試驗從鄭州地區牛場采集糞便及牛奶樣品共146份，對大腸桿菌O157∶H7進行了分離鑒定，并對其生物學特性進行了分析，為動物源大腸桿菌O157∶H7流行病學研究提供了資料，也為大腸桿菌O157∶H7的防控奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1樣品采集 取自鄭州地區3個不同奶牛場健康成年泌乳奶牛排出的新鮮糞便及鮮牛奶。每份新鮮糞便樣品分別裝入一次性的自封袋內；生鮮牛奶直接裝入滅菌試管。所有的樣品均放于低溫冰盒中，24 h內送往實驗室，每批樣品均統一處理。

1.2菌種 大腸桿菌O157∶H7標準菌株ATCC 43895由河南省動物源性食品安全重點實驗室提供；所用菌株均用30%甘油保存在-70 ℃。

1.3主要試劑與儀器 大腸桿菌O157∶H7選擇性培養基購自廣東環凱微生物科技有限公司； 2×PCR TaqMix購自北京美萊博醫學科技有限公司；微量生化鑒定管購自杭州天和微生物試劑有限公司。PCR儀(Bio-rad，PTC-200 PCR擴增儀，USA)紫外凝膠成像儀(美國ALPHA INNOTECH)；紫外分析儀天UV-2000(天能科技上海有限公司)。

1.4引物設計與合成 參考GenBank公布的EHEC O157∶H7的rfbE基因(參考序列S83460)、fliC基因(參考序列AF228488)、hlyA基因(參考序列EU118026.1)序列和文獻報道的Stx2基因、eaeA基因序列，應用Primer Premier 5.0生物軟件設計出符合多重PCR要求的5對引物。引物由上海博尚生物技術有限公司合成。各引物序列及擴增長度見表1。

表1 試驗引物序列及預計擴增長度

1.5大腸桿菌O157∶H7分離、鑒定 按常規方法將樣品經預增菌處理后[10]，接種于大腸桿菌O157∶H7顯色培養基上，篩選純化出疑似大腸桿菌O157∶H7菌株，然后應用本試驗室已建立的大腸桿菌O157∶H7雙重PCR方法對疑似菌株進行鑒定。

1.6大腸桿菌O157∶H7臨床分離株的生物學特性研究

1.6.1生化試驗 取生長良好的紅色菌落接種于營養肉湯，37 ℃溫箱培養24 h ，按常規方法進行生化試驗，主要包括吲哚試驗、V-P試驗、糖類發酵試驗、尿素酶試驗以及檸檬酸鹽試驗、硫化氫試驗、丙二酸鹽試驗等。

1.6.2生長曲線的測定與繪制 使用分光光度計測定大腸桿菌O157∶H7標準株和臨床分離株的OD600值。每隔0.5 h測量1次，并對濃度大的菌懸液用未接種的LB液體培養基適當稀釋后測定，使其OD600值在0.50～1.00以內，經稀釋后測得的OD值要乘以稀釋倍數，才是培養液實際的OD值。重復測定3次，以上述各個測定點的時間為橫坐標，OD600值為縱坐標，繪制大腸桿菌O157∶H7的生長曲線。

1.6.3生物被膜的形成 采用試管法和玻片法兩種方法。

1.6.3.1試管法 將菌液于無菌條件下接種于液體LB中，37 ℃恒溫箱中培養。分別于8、24、36、48和72 h時取出試管，將試管中液體棄去，用PBS漂洗3次，甲醇固定1 min，棄去，加入結晶紫染色15 min，吸取試管中多余的結晶紫染色液后，在自來水下沖洗試管3～5 min，把試管倒置在濾紙上除去過多的水，并在37 ℃烘箱中烘干，觀察，記錄。

1.6.3.2玻片法 菌液用LB培養基1∶200稀釋, 取3 mL置6孔細胞培養板中，放入無菌蓋玻片，37 ℃培養，每24 h換液一次。分別于第8、24、36、48和72 h取出蓋玻片，PBS漂洗3次，除去浮游細菌，用10%甲醇將細菌固定15 min，結晶紫染色5 min，自來水沖去多余染色液，晾干后，用樹膠將蓋玻片粘到載玻片上，鏡檢。

1.7大腸桿菌O157∶H7臨床分離株的毒力基因檢測 為了解分離的2株大腸桿菌O157∶H7攜帶毒力基因的情況，針對大腸桿菌O157∶H7的細胞溶血素hlyA基因、志賀菌素stx2基因以及黏附基因eaeA設計特異性引物，應用實驗室已建立的多重PCR方法對其進行檢測與分析[11]。

2 結 果

2.1大腸桿菌O157∶H7臨床分離株的分離鑒定 采集的樣品經初步增菌培養，在麥康凱瓊脂平板上進行純化培養，然后經大腸桿菌O157∶H7選擇性培養基初步分離后，再經多重PCR對其鑒定。結果表明本次從牛場采集的樣品，共分離到2株大腸桿菌O157∶H7，分別命名為L1和L2，其檢出率為1.4%。PCR檢測結果見圖1。

圖1大腸桿菌O157∶H7PCR檢測結果

Fig.1ResultsofPCRtodetecttheEscherichiacoliO157∶H7isolates

M: DL2000 DNA marker; +: Positive control;-: Negative control; 1: L1 isolate; 2: L2.

2.2大腸桿菌O157∶H7臨床分離株的生物學特性試驗結果

2.2.1生化試驗結果 大腸桿菌O157∶H7標準株和臨床分離株的生化試驗結果顯示：靛基質陽性，V-P陰性，不利用檸檬酸鹽，不產H2S等，3株菌所得結果均相同，均符合大腸桿菌的常規生化特性。另外，尿素酶試驗、精氨酸雙水解酶試驗、部分糖類的發酵試驗結果有一定差異，試驗中3株菌均發酵山梨醇并產氣，這一點與文獻報道的大多數大腸桿菌O157∶H7不同。具體的生化特性見表2。

2.2.2大腸桿菌O157∶H7生長曲線的測定與繪制 使用754紫外分光光度計測定細菌的OD600值，將同時接種的菌液每隔0.5 h測定1次，根據OD值測定結果繪制出生長曲線，結果如圖2所示。與標準菌株相比，大腸桿菌O157∶H7 臨床分離株L1和L2進入對數生長期的時間較早，進入平臺期的時間也較早。L1和L2菌株的生長曲線比較一致。

圖2大腸桿菌O157∶H7在LB培養基中的生長曲線

Fig.2GrowthcurveofEscherichiacoliO157∶H7inLBculturemedium

表2 大腸桿菌O157∶H7各項生化試驗結果

Note: “⊕” shows producing acid and gas; “+” shows yielding acid; “-” shows negative reaction.

2.2.3大腸桿菌O157∶H7生物被膜形成的結果

2.2.3.1試管法 利用玻璃試管法直觀在試管壁上觀察生物被膜，可見標準株接種后24 h細菌開始粘附于試管壁，36 h形成完整的被膜，48 h后細菌開始脫落。臨床分離株L1接種后36 h細菌開始明顯的粘附于試管壁，48 h形成完整的被膜，72 h后細菌開始脫落。臨床分離株L2接種后24 h細菌開始大量粘附于試管壁，36 h形成完整的被膜，48 h后細菌開始脫落。

2.2.3.2玻片法 應用玻片法觀察生物被膜的形成(見圖3A-C)，結果顯示標準株生物被膜在24 h處于細菌起始粘附過程，可觀察到少量細菌開始粘附于載體上；至36 h已經形成成熟完整生物被膜，大量微菌落連成片狀；48 h后微菌落減少，生物被膜開始脫落，結果如圖3(A)。臨床分離株L1生物被膜在24 h處于細菌起始粘附過程，可觀察到少量細菌開始粘附于載體上；至48 h已經形成成熟完整生物被膜，大量微菌落連成片狀；72 h后微菌落減少，生物被膜開始脫落，結果如圖3(B)。臨床分離株L2生物被膜在24 h處于細菌起始粘附過程，可觀察到少量細菌開始粘附于載體上；至36 h已經形成成熟完整生物被膜，大量微菌落連成片狀；48 h后微菌落減少，生物被膜開始脫落，結果如圖3(C)。

2.3大腸桿菌O157∶H7臨床分離株的毒力基因檢測結果 對2株大腸桿菌O157∶H7臨床分離株攜帶的毒力基因(rfbE基因、fliC基因、hlyA基因、eaeA基因和stx2基因)進行多重PCR擴增，多重PCR檢測結果(見圖4)：2株菌株均攜帶有hlyA基因和eaeA基因, L1攜帶Stx2基因。

3 討 論

腸出血性大腸桿菌O157∶H7感染性腹瀉是近年來新發現的危害嚴重的腸道傳染病，主要通過食物傳播，牛、羊、豬和雞等家畜家禽是其主要宿主，其中以牛的帶菌率最高，而且牛一旦感染這種細菌，排菌時間至少為1年。有報道稱人感染10個活菌可致病，因此，加強動物源性大腸桿菌O157∶H7的流行病學調查對該病的防治具有重大意義。為了解鄭州地區牛攜帶大腸桿菌 O157∶H7的情況，收集糞便和新鮮牛奶共146份，應用實驗室已建立的大腸桿菌 O157∶H7多重PCR方法對其進行了檢測，共分離出2株大腸桿菌 O157∶H7，進一步對臨床分離的動物源大腸桿菌O157∶H7的生物學特性以及攜帶的毒力基因情況進行了檢測分析，為大腸桿菌O157的流行病學調查研究奠定基礎。

圖3(A) 動物源大腸桿菌O157∶H7標準株生物被膜形成(400×)

圖3(B) 動物源大腸桿菌O157∶H7臨床分離株L1生物被膜形成(400×)

圖4大腸桿菌O157∶H7毒力基因的多重PCR檢測結果

Fig.4ResultsofmultiplexPCRtodetectthevirulencegenesoftheEscherichiacoliO157∶H7isolates

M: DL2000 DNA marker; +: Positive control;-: Negative control; 1: L1 isolate; 2: L2 isolate.

3.1生化試驗 細菌生化試驗是細菌生物學特性中的重要一環，通過生化試驗可以初步鑒別不同菌株的差異。尿素酶、精氨酸雙水解酶試驗，乳糖、蔗糖、L-阿拉伯糖和木糖這些糖類發酵試驗大腸桿菌O157∶H7的3株菌之間均有差異，這可能與菌株來源和攜帶毒力因子有一定關系，從而表現出一定的差異，為進一步研究提供了初步依據。

許多文獻報道大腸桿菌O157∶H7均為山梨醇陰性或遲緩陽性，本生化試驗中山梨醇試驗O157∶H7標準株和臨床分離株均為陽性并產氣，根據這一特性，可以選用山梨醇麥康凱瓊脂鑒定其準確性。2006年，范放等[12]分離到一株山梨醇陽性菌株，2011年，張書蕭[13]研究中又分離到一株分解山梨醇的大腸桿菌O157∶H7菌株，因此在進行大腸桿菌O157∶H7初篩時，需要慎重選擇培養基，在出現此類情況時應反復進行驗證。

3.2生長曲線 不同來源的細菌有其各自不同的生長規律，同一種細菌不同的表現型也會有不同的生長規律。大腸桿菌O157∶H7生長曲線的測定結果表明，動物源大腸桿菌O157∶H7臨床分離株L1、L2比標準株的遲緩期短，較早的進入對數生長期；大腸桿菌O157∶H7標準株生長曲線的斜率小于臨床分離株L1、L2的斜率；大腸桿菌O157∶H7標準株比臨床分離株L1、L2的穩定期短。從而說明攜帶不同毒力基因的動物源性大腸桿菌O157∶H7之間的生長曲線存在差異，不同來源的菌株及有無攜帶毒力因子的菌株生長曲線對數末期的不同，選擇合適的時間用于如小鼠灌毒試驗、細胞粘附試驗等試驗的研究。

3.3生物被膜 生物被膜作為自然界中細菌主要的生存方式，給人類的生產生活帶來了嚴重危害。許多研究表明生物被膜中菌體表現出對抗生素的高度不敏感[14]，生物被膜一旦形成, 被膜深層細菌對抗生素的抗性最高可達浮游細菌的1 000倍[15]，且成為潛在的感染源, 被膜向周圍環境緩慢釋放浮游菌, 引起反復性和難治性感染。本試驗采用試管法和玻片法對臨床分離的攜帶不同毒力基因的大腸桿菌O157∶H7生物被膜的生長情況進行了72 h的連續觀察，生物培養膜片和玻璃試管上的生物被膜生長周期是一致的。

結果顯示攜帶不同毒力基因的大腸桿菌O157∶H7生物被膜形成時間有差異，標準株和L2形成生物被膜較早，L1較晚，即標準株和L2完整的生物被膜是在36 h時形成的，L1菌株完整生物被膜是在48 h。此現象可能為其來自不同的宿主，所攜帶的毒力因子不同，毒力因子在大腸桿菌O157∶H7的免疫致病過程中起著重要作用，不同宿主來源的大腸桿菌O157∶H7其攜帶的毒力因子也不完全相同，因此，不同來源的大腸桿菌O157∶H7菌株其生物學特性、粘附特性等均有一定差別。

3.4毒力基因的檢測 由于大腸桿菌O157∶H7的致病力取決于其攜帶的毒力基因，所以對大腸桿菌O157∶H7毒力基因的檢測非常必要。大腸桿菌O157∶H7的毒力基因主要有：產生細胞溶血素的hylA基因，產生志賀菌素的stx1和stx2基因，產生大腸桿菌黏附毒素的eaeA基因等。據報道人類感染大腸桿菌后發病多與stxl、stx2和eaeA等有關[13, 15]，因此本試驗從牛源樣品中分離大腸桿菌O157∶H7，并根據GenBank中編碼大腸桿菌O157的O抗原的rfbE基因、H抗原的fliC基因、細胞溶血素的hlyA基因、志賀菌素的stx2基因以及大腸桿菌黏附素的eaeA基因為靶基因的5種基因的特異性序列，設計并合成5對引物，運用多重PCR方法快速的檢測大腸桿菌O157∶H7臨床分離株所攜帶的毒力基因，結果表明2株大腸桿菌O157∶H7均帶有hlyA、eaeA基因，一株還帶有Stx2毒力基因，為進一步研究大腸桿菌O157∶H7的致病機制奠定了基礎。關于各毒力基因之間的關系，以及各毒力基因在大腸桿菌O157∶H7致病過程中的作用機制，尚待進一步研究。

參考文獻：

[1]Guo Y,Liu D,Bian Z,et al. Down-regulation of platelet surface CD47 expression inEscherichiacoliO157∶H7 infection-induced thrombocytopenia[J]. PLoS One,2009, 4(9): e7131. DOI: 10.1371/journal.pone.0007131

[2]Luo P, Zeng H,Yi Y,et al. Construction, expression, and immunogenicity identification of STX2 A1 subunit protein of EHEC O157∶H7[J]. Immunol J, 2008,24(3): 287-290. (in Chinese)

羅萍, 曾浩, 易勇, 等.EHECO157∶H7 志賀毒素ⅡA1亞單位蛋白的構建表達與免疫原性鑒定 [J]. 免疫學雜志, 2008, 24(3): 287-290.

[3]Pan QX, Wang YS, Liu H, et al. Expression and identification of rfbE and fliC genes of enterohemorrhagicE.coli(EHEC) O157∶H7[J]. Jiangsu J Agr Sci, 2009, 25(3): 568-571. (in Chinese)

潘群興, 王永山, 劉潔, 等. 腸出血性大腸桿菌 O157∶H7 rfbE 與 fliC 基因的表達及鑒定[J]. 江蘇農業學報, 2009, 25(3): 568-571.

[4]Ye Q,Shi MK,Liu B,et al.Etiological and epidemic analysis ofEscherichiacoliO157∶H7 in Hebei Province[J]. Chin J Public Health, 2000,16(7): 613-614. DOI: 10. 1007/s00192-011-1474-4

葉青,史明坤,劉波,等. 河北省 O157∶H7大腸桿菌病原學和流行病學研究[J]. 中國公共衛生, 2000,16(7): 613-614. DOI: 10. 1007/s00192-011-1474-4

[5]Chao QG, Yang XM, Ge Y, et al. PCR for detecting animal-derivedEscherichiacoliO157∶H7[J]. Food Sci, 2010, 31(8): 212-215. (in Chinese)

巢強國,楊學明,葛宇,等. PCR法檢測食品中大腸桿菌O157∶H7[J]. 食品科學, 2010, 31(8): 212-215.

[6]Slutsker L, Ries AA, Greene KD, et al.EscherichiacoliO157∶H7 diarrhea in the United States: clinical and epidemiologic features[J]. Ann Internal Med, 1997, 126 (7): 505-513. DOI: 10.7326/0003-4819-126-7-199704010-00002

[7]Ye J, Zhan L, Lu Q, et al. Surveillance and molecular characterization ofEscherichiacoliO157 in Zhejiang province[J]. Chin J Zoonoses, 2008,24(3): 247-251. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2694.2008.03.015 (in Chinese)

葉菊蓮, 占利, 陸群英, 等. 浙江省O157大腸桿菌監測及其分子生物學特性[J]. 中國人獸共患病學報, 2008，24(3): 247-251. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2694.2008.03.015

[8]Wang G, Clark CG, Rodgers FG. Detection inEscherichiacoliof the genes encoding the major virulence factors, the genes defining the O157∶H7 serotype, and components of the type 2 Shiga toxin family by multiplex PCR[J]. J Clin Microbiol, 2002, 40(10): 3613-3619.

[9]Fagan PK, Hornitzky MA, Bettelheim KA, et al. Detection of Shiga-like toxin (stx1 andstx2), intimin (eaeA), and enterohemorrhagicEscherichiacoli(EHEC) hemolysin (EHEC hlyA) genes in animal feces by multiplex PCR[J]. Appl Environ Microbiol, 1999, 65(2): 868-872.

[10]Shen P, Chen X, Wei B. Microbiolgy[M]. Beijing: Higher Education Press, 2009. (in Chinese)

沈萍, 陳向東, 衛揚保. 微生物學[M]. 北京：高等教育出版社, 2009.

[11]Chen Y, Hu H, Duan Z, et al. A preliminary study on multiplex PCR for detecting animal-derivedEscherichiacoliO157∶H7[J]. Acta Agriculturae Boreali-Sinica, 2011, 26(5): 87-91. (in Chinese)

陳雅君, 胡慧, 段志剛, 等. 動物源大腸桿菌 O157∶H7 多重PCR檢測方法的初步研究[J]. 華北農學報, 2011, 26(5): 87-91.

[12]Fan F, Situ C, Huang L, et al. Detection of entro-hemorrhagucE.coliO157∶H7 with sorbitol-positive and analysis[J]. Chin J Pest Ctrl, 2006, 2: 4. (in Chinese)

范放, 司徒翠華, 黃李華, 等. 檢出山梨醇陽性腸出血性大腸桿菌 O157∶H7一例及特征分析[J]. 醫學動物防制, 2006,2:4.

[13]Zhang SX, Liu G, Shao DH, et al. Isolation and identification of Shiga toxin type 2 producing and sorbitol-positiveEscherichiacoliO157∶H7[J]. Chin J Anim Infect Dis, 2011, 19(4): 30-34. (in Chinese)

張書蕭, 劉姑, 邵東華, 等. 一株產志賀毒素 Ⅱ 且山梨醇陽性的大腸桿菌 O157∶H7 的分離與鑒定[J]. 中國動物傳染病學報, 2011,19(4):30-34.

[14]Walters MC, Roe F, Bugnicourt A, et al. Contributions of antibiotic penetration, oxygen limitation, and low metabolic activity to tolerance ofPseudomonasaeruginosabiofilms to ciprofloxacin and tobramycin[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2003, 47(1): 317-323. DOI: 10.1128/AAC.47.1.317-323.2003

[15]Mah TC, O'Toole GA. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents[J]. Trends Microbiol, 2001, 9(1): 34-39. DOI: 10.1016/S0966-842X(00)01913-2