布魯氏菌外膜蛋白 VirB4在感染胚胎滋養層細胞中的作用分析

孫志華,劉良波,張 豫,劉 娟,韓玉霞,劉來珍,郭 乾,陳創夫,張 輝

布魯氏菌病(Brucellosis)是由布魯氏菌(Brucella)引起的動物源性人獸共患傳染病[1]。屬“家畜、家禽防疫條例實施細則”中二類傳染病，在世界范圍內廣泛流行，尤其在中國，近年來，全世界范圍內有回升的勢頭[2]。布魯氏菌是一種兼性胞內寄生菌，革蘭氏染色陰性，可引起天然宿主網狀內皮系統持續性感染[3]。在家畜和野生動物中，主要引起雌性的流產、繁殖生育能力的下降；致使雄性發生睪丸炎、附睪炎，最終發展為不育癥。人感染后出現“波浪熱”，心內膜炎，腦炎以及關節和腰部脊柱疼痛等癥狀[4]。在急性感染期，布魯氏菌可侵襲胎盤絨毛膜的滋養層細胞，容易引起母畜流產，但是其分子機制目前尚不完全清楚[5]。巨噬細胞和胚胎滋養細胞是布魯氏菌主要宿主細胞，virB區編碼的Ⅳ型分泌系統(T4SS)在布魯菌感染宿主過程中發揮著重要作用[6-7]。布魯氏菌T4SS由virB操縱子編碼，共12個基因(virB1-virB12)；由同一啟動子調控，是一個多蛋白的跨膜復合物，受宿主細胞類型、生長溫度、營養條件、pH值等因素調控[8]。其中VirB4暴露于細胞液中，有一個完整的三磷酸核苷酸結合區，對物質的運輸起重要作用。進一步的研究表明，virB4是流產相關基因[9]。Kim[10]等采用缺失virB4基因的牛種布魯氏菌疫苗株S19的突變株接種孕期母鼠，發現突變株可以在胎盤中繁殖，其侵染力和繁殖力下降，不會引起流產。由此可見布魯氏菌VirB4蛋白與侵染宿主引起的流產密切相關。因此，探索布魯氏菌Ⅳ型分泌系統的毒力因子和滋養層細胞靶蛋白的結合機制，為進一步闡明布魯氏菌胞內寄生機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1菌株 釀酒酵母菌株AH109(MATα表型)、釀酒酵母菌株Y187(GMATa表型)均購自Clontech公司，布魯氏菌RB51株和大腸桿菌E.coliDH5α為本實驗室保存。

1.1.2試劑 膠原酶Ⅰ購自美國Gibco公司；TGS購自上海麥莎生物科技有限公司；熒光素酶標記羊抗鼠IgG購自北京博奧森生物技術有限公司；RNA提取試劑Trizol購自Invitrogen公司；cDNA文庫構建試劑盒、雙鏈cDNA純化試劑盒、酵母感受態細胞的制備試劑盒、YPD培養基，SD/-Leu等營養選擇性培養均購自Clotech公司；酵母質粒抽提試劑盒、SYBR Green熒光染料均購自北京天根生化科技有限公司；T4 DNA連接酶試劑盒，DNA Marker購自北京天為時代有限公司；限制性內切酶NdeI/PstI購自上海生工生物工程技術服務公司；Taq DNA聚合酶、dNTPs、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、pMD18-T克隆載體、離心柱型質粒小題試劑盒均購自天根生化科技有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2試驗方法

1.2.1牛胚胎滋養層細胞的分離與培養 取懷孕45～60 d母牛完整子宮，無菌條件下收集胎兒子葉，采用膠原酶消化方法分離胚胎滋養層細胞，經培養純化達到實驗要求后備用。

1.2.2布魯氏菌侵染牛胚胎滋養層細胞 cDNA文庫的構建 布魯氏菌RB51以100∶1(細菌個數∶細胞個數)的比例侵染牛胚胎滋養層細胞，提取侵染后滋養層細胞總RNA，然后逆轉錄20 μL 的cDNA，再以cDNA為模板進行PCR檢測。

1.2.3布魯氏菌virB4基因酵母表達載體的構建

1.2.3.1目的基因的擴增 設計并由上海生工合成virB4基因的引物，其上游：5′-CATATGGGCGCTCAATCCAAATAC-3′；下游：5′-CTGC

AGTCACCTTCCTGTTGATTTGGAC-3′。PCR

反應體系(20 μL)：10×PCR buffer 2 μL，dNTP 0.8 μL，上、下游引物各0.2 μL，模板2 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，去離子水14.3 μL。反應條件：94 ℃ 1 min，57 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min 40 s。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果，回收目的片段，連接pMD18-T載體,轉化E.coliDH5α感受態，在含Amp(50 μg/mL)的 LB平板上篩選陽性菌落，經菌液 PCR鑒定后，搖菌，進行酶切和測序鑒定。

1.2.3.2酵母表達載體的構建 連接目的基因virB4和pGBKT7得到誘餌質粒 pGBKT7- virB4；將 pGBKT7-virB4重組子轉化至E.coliDE3感受態細胞，混勻、冰浴、熱擊轉化后均勻涂布于于含Kan(50 μg/mL)的LB平板上；挑取 PCR鑒定陽性的菌落于LB液體培養基中過夜培養，提取質粒，-20 ℃保存，備用。

1.2.3.3pGBKT7-virB4重組質粒的轉化 選取SD/-Leu和SD/-His陰性、SD/-Ura和YPDA陽性的釀酒酵母菌株Y187按Clontech公司的YeastmakerTMYeast Transformation System 2說明書制備感受態細胞；采用醋酸鋰法將 pGBKT7-virB4重組質粒轉化至新制備的釀酒酵母菌Y187感受態細胞中，涂布于SD/-Trp/Kan(20 μg/mL)平板上，30 ℃培養4 d；對長出的轉化子進行菌落PCR擴增，經1%瓊脂糖凝膠電泳后在凝膠顯像系統中觀察。

1.2.3.4釀酒酵母菌Y187(pGBKT7-virB4)自激活檢測和毒性檢測 將釀酒酵母菌Y187(pGBKT7-virB4)涂于 SD/-Trp和 SD/-Trp-His平板上，30 ℃培養4～5 d，觀察 SD/-Trp和 SD/-Trp-His平板上菌落的生長情況；從SD/-Trp平板上挑選單個菌落進行X-α-Gal分析，挑取釀酒酵母菌Y187陽性轉化子接種到80 mL SD/-Trp/Kan(20 μg/mL)液體培養基上，30 ℃培養20 h，檢測菌液的 OD值。

1.2.4酵母雙雜交篩選與布魯氏菌VirB4相互作用的滋養層細胞捕獲蛋白

1.2.4.1酵母雙雜交陰、陽性對照體系的建立 將 pGADT7-T轉化AH109酵母感受態細胞作為對照prey 體系；將pGBKT7-53與pGBKT7-Lam轉化Y187酵母感受態細胞作為對照bait體系。挑取攜帶有pGADT7-T質粒的AH109菌斑與攜帶有pGBKT7-53質粒的Y187菌斑，將兩種菌斑置于盛有500 μL 2×YPD 的1.5 mL離心管中，30 ℃，40 r/min搖菌培養20 h，離心棄上清，500 μL 2×YPD懸浮沉淀，取100 μL涂于SD/Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal 平板上，30 ℃ 倒置培養4 d。

1.2.4.2pGBKT7-virB4 與滋養層細胞cDNA 捕獲文庫的互作試驗 分別挑取攜帶有 pGBKT7-virB4 的Y187菌斑接種到100 mL SD/-Trp/Kanr(50 μg/mL)液體培養基，30 ℃ 恒溫箱，54 r/min培養20 h，離心濃縮菌落，使菌落濃度≥1×109cells/mL；從-80℃冰箱中取出一管分裝的濃度大于2×107cells/mL的5 mL的凍存管的酵母菌AH109 (pGADT7-cDNA liberary)，融化后，向滅菌處理的2 L三角瓶中依次加入45 mL 2×YPD/Kanr(50 μg/mL)、2 mL酵母菌 AH109(pGADT7-cDNA liberary)、5mL Y187(pGBKT7-virB4)，無菌處理后，30 ℃ ，54 r/min搖菌培養20 h，離心棄上清，用50 mL 0.5×YPD/Kanr(50 μg/mL)洗滌兩次，用1 mL 0.5×YPD/Kanr(50 μg/mL)重懸沉淀，將菌懸液平均涂50個直徑為150 mm的SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp平板，30 ℃ 倒置培養4 d。

1.2.4.3陽性菌落的 X-α-Gal 藍斑篩選 將在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp 平板上長出的菌落轉接于的SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal平板上。置于30 ℃培養溫箱，觀察并記錄。

1.2.4.4陽性菌落的質粒提取及鑒定 將SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal平板上變藍的酵母菌分別接種到SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp液體培養基上，30 ℃ 培養，250 r/min培養72 h，用酵母小提質粒試劑盒進行質粒提取并用1.2 %瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.5特異結合蛋白輔酶 Q10和 SLC3A2 的 mRNA 表達檢測

1.2.5.1引物的設計和合成 依據 GenBank所收錄的全序列，采用 Primer 5.0軟件設計輔酶 Q10和 SLC3A2的引物序列，輔酶 Q10上游：5′-CCCGTCGATGTTTAGAGGAA-3′，下游5′-TTTGTCCAGCACACACTCGT-3′； SLC3A2上游：5′-ACCCCAGTGTTCAGCTATGG-3′，下游為：5′-ATGCTGAGGTGTTGGGAAAG-3′。

1.2.5.2目的基因 PCR 擴增及產物的純化 以100∶1(細菌個數∶細胞個數)的比例，用布魯氏菌RB51和S19株侵染滋養層細胞。用 TRIZOL試劑盒提取總RNA，反轉錄為cDNA后為模板，用PCR方法擴增得到輔酶 Q10和 SLC3A2的基因片段。PCR擴增體系(20.0 μL)：10×反應緩沖液(含15.0 mmol/L MgCl2) 2.0 μL，dNTP(各2.5 mmol/L) 0.8 μL，上、下游引物各(25 μmol/L)0.2 μL，模板2 μL，Taq DNA聚合酶(2.5 U/μL) 0.5 μL，補水至20.0 μL；PCR反應條件：95 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環；最后72 ℃延伸7 min。PCR產物進行1.5 %瓊脂糖凝膠電泳分析，并以瓊脂糖凝膠DNA回收純化試劑盒進行純化，操作方法按產品說明書進行。

1.2.5.3實時定量RCR檢測mRNA表達量的變化 構建pMD18-T-Q10和pMD18-T-SLC3A2質粒，挑選陽性克隆，進行菌液PCR鑒定，提質粒。經鑒定正確后的陽性質粒作為標準品備用。用微量紫外分光光度計測定 A260/280質粒濃度，做記錄后，按公式算成拷貝數后，將其10倍系列稀釋成含有101～109的9個梯度，作為模板，在12.5 μL PCR反應體系中加入：上，下游引物各0.5 μL，模板1 μL，SYBR 6.25 μL，補水至12.5 μL；按實時定量PCR反應3步法在 MaXro3000實時熒光定量 PCR儀進行，數據被收集后，繪制擴增曲線，標準曲線和熔解曲線，利用制作的標準曲線比較經布魯氏菌RB51和S19侵染前后蛋白表達量的變化。

2 結 果

2.1cDNA文庫的建立

2.1.1總RNA檢測結果 1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳顯示28S、18S和5.8S rRNA條帶清晰，28S rRNA與18S rRNA的比例約為2∶1，總 RNA的完整性良好(圖1)。分光光度計檢測3.5 h提取的總RNA純度，測得A260/280值分別為1.90，表明總 RNA純度較高。LD-PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，可見文庫ds cDNA呈瀑布狀分布，大小在0.2～4 kb范圍，在接近1 kb左右的區域較為密集(圖2)。

圖1 總RNA凝膠電泳

圖2LD-PCR凝膠電泳

Fig.2DetectionofLD-PCRproducts

1: LD-PCR products; M: Marker IV

2.2cDNA文庫的篩選

2.2.1文庫轉化效率檢測結果 對隨機選取10個平板進行菌落計數，計算出1個平板的平均菌落數為650個，共計200個平板，則cDNA文庫庫容量為1.3×106個轉化子，即在3 μg pGADT7-Rec(0.5 μg/μL)線性化載體中，有1.3×106個載體發生重組，達到了建庫的要求，即> 1×106轉化子/3 μg pGADT7-Rec。

2.2.2cDNA 文庫的污染檢測結果 將回收后的cDNA文庫的平均涂于5個直徑為150 mm SD/-Leu YPD平板 30 ℃恒溫培養3 d后，未見霉斑、絲狀物等出現，說明回收的文庫沒有受到污染。

2.2.3cDNA文庫插入片段長度評價結果 從平板上隨機挑取65個單克隆，提取質粒，用文庫擴增引物擴增插入片段，進行瓊脂糖電泳，圖3中是其中的23個克隆，結果表明該文庫的 cDNA插入片段在0.2～5.0 kb之間。

2．3與 virB4 互作蛋白的初步驗證

圖3cDNA文庫插入片段的PCR鑒定

Fig.3DetectionofinsertsofcDNAlibrary

1-23: Clones of cDNA library; 24: Negative control.

2.3.1pGBKT7-virB4 的PCR和酶切鑒定結果 菌落PCR擴增片段大小在2 000～3 000 bp之間，與預期結果2 496 bp一致。pGBKT7-virB4質粒經NdeI/PstI雙酶切后，電泳結果與預期(2 496 bp)相符(見圖4)。

圖4重組質粒pGBKT7-virB4的PCR擴增

Fig.4PCRamplificationofrecombinantplasmidpGBKT7-virB4

1-5: pGBKT7-virB4 PCR product; 6: Positive control; 7: Negative control

2.3.2轉化子Y187的鑒定 以SD/-Trp/Kan20 μg/mL固體培養基長出的菌落為模板進行PCR鑒定，結果出現1條約2 596 bp的 DNA片段，大小與目標片段一致(圖5)。

圖5Y187轉化子PCR鑒定

Fig.5Y187transformantamplifiedbyPCR

1-5: PCR product; 6: Negative control.

2.3.3自激活檢測和毒性檢測 經過培養，SD/-Trp平板上長出100個左右的直徑為2～3 mm的菌落；在SD/-Trp-His平板上沒有菌落出現；經X-α-Gal分析無藍色菌落出現，表明無自激活活性。挑取酵母菌Y187陽性轉化子接種到80 mL SD/-Trp/Kan(20 μg/mL)液體培養基上，30 ℃，250 r/min培養20 h，菌液的OD值大于0.8，表明Y187陽性轉化子無毒性。

2.3.4酵母雙雜交陰性、陽性對照結果 酵母菌株AH109 (pGADT7-T)與酵母菌株Y187 (pGBKT7-53)經配合后，在SD/Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal的平板上長出直徑為2～3 mm的藍色菌落，而在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal未長出菌落。

2.3.5VirB4誘餌蛋白 X-α-Gal篩選 酵母菌株 AH109 (pGADT7-liberary)與酵母菌株Y187(pGBKT7-virB4)經配合后，在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp的平板上長出直徑為2～3 mm的菌落。

再將這些菌落轉接到SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal，部分菌落變藍(圖6)。

圖6 VirB4 誘餌蛋白篩選陽性結果

2.3.6VirB4誘餌蛋白基因捕獲 prey 蛋白基因的序列分析 pGBKT7-virB4誘餌質粒最終獲得13個陽性AD質粒，Blastn序列分析結果(見表1)。

表1 陽性AD質粒Blastn分析結果

2.3.7侵染前后輔酶Q10和SLC3A2基因表達量的變化 基因輔酶Q10的標準曲線方程：y=-3.52×LOG(X)+40.34，相關系數為0.998，擴增效率為89.8%。基因SLC3A2的標準曲線方程：y=-4.147×LOG(X)+45.94，相關系數為0.993，擴增效率為74.2%。同樣的標準曲線條件下，檢測布魯氏菌S19和RB51侵染前后輔酶Q10基因和SLC3A2基因表達量的前后變化(以未侵染的cDNA為對照)，測得各自的擴增曲線，發現侵染后輔酶Q10和SLC3A2的表達量均提高了(圖7)。

3 討 論

布魯氏菌是兼性胞內寄生菌[11],胚胎滋養層細胞是布魯氏菌侵染的靶細胞。胚胎滋養層細胞受到損傷會引發強烈的炎癥反應，影響胎兒向母體的植入，容易引發母畜流產[12]。布魯氏菌不產生外毒素，布魯氏菌的毒力主要表現在其侵襲力以及在宿主內的生存和繁殖能力。因此，布魯氏菌的毒力因素一直是布病病原學中重要的研究問題之一，與布魯氏菌病的發病機理、免疫機制乃至臨床治療和預防等息息相關。布魯氏菌侵入細胞形成布氏小體后，能有效的阻止布氏小體和溶酶體融合，致使布魯氏菌能在細胞中寄生、繁殖。本文研究病原外膜蛋白與宿主細胞間的互作為布魯氏菌新型藥物的研發、家畜布病預防和治療提供科學依據。

圖7布魯氏菌侵染前后輔酶Q10和SLC3A2基因表達量的變化

Fig.7ExpressionofcoenzymeQ10andSLC3A2geneafterBrucellainfection

virB是布魯氏菌毒力基因，與宿主細胞胞內生存、復制有關。1999年，T4SS首次由O’Callaghan[13]在豬布魯氏菌中發現，該系統是一個復合體，由12個跨越細菌胞壁的不同蛋白構成，形成一個操縱子，是細菌在宿主細胞內復制和持續感染不可缺少的。VirB結構的改變直接影響到布魯氏菌外膜的結構和性質，直至影響到布魯氏菌的胞內適應和存活[8]。VirB1是T4SS非必需的組件；VirB3、VirB6、VirB7、VirB8、VirB9、VirB10分布于胞膜孔道中可以傳送信號；VirB4和VirB11是兩個ATP酶分子，其中VirB4有一個完整的ATP結合區。Kim[10]等采用缺失VirB4基因的牛種布魯氏菌疫苗株S19的突變株接種孕期母鼠，發現突變株可以在胎盤中繁殖，其侵染力和繁殖力下降，不會引起流產。可見，布魯氏菌VirB4蛋白與侵染宿主引起流產密切相關，在本研究中篩選牛種布魯氏菌疫苗株VirB4蛋白在侵染牛胚胎滋養層細胞過程潛在的結合靶蛋白，為揭示牛種布魯氏菌感染與母畜流產之間的分子作用機制奠定基礎。另外，本實驗中克隆的VirB4基因，與參考株基因的同源性很高，有4個突變位點，全部為有義突變，所以表達的蛋白也會和參考株不一樣，毒力是否受到了影響需進行進一步研究探討。

輔酶Q10在細胞內與線粒體內膜結合，參與細胞氧化磷酸化及ATP生成過程，是呼吸鏈中重要的遞氫體[14-15]，是細胞自身產生的天然抗氧化劑和細胞代謝的激活劑，能夠提高有機體的免疫力。Folkers K[16]報道了老鼠服用了輔酶Q10能提高機體免疫細胞殺死細菌的活力，激發免疫球蛋白和抗體數量。本研究證實布魯氏菌侵染宿主細胞后引起VirB4互作的靶蛋白輔酶Q10的表達量具有明顯升高，這可能是布魯氏菌侵染宿主細胞后的應激反應，促使輔酶Q10表達量提升，表明其在布魯氏菌引發的致炎過程中起重要作用。SLC3A2是一個II型跨膜蛋白，具有催化鈣：鈉逆向運輸蛋白的功能；與糖代謝、鈣離子運輸、氨基酸運輸、細胞生長相關[17]。Ca2+達到一定濃度后,啟動一系列病理生理機制損傷神經細胞，誘導細胞凋亡、甚至死亡，而SLC3A2催化Na+-Ca2+逆向運輸蛋白[18]。本研究也證實了布魯氏菌侵染引起SLC3A2表達量升高，這可能在布魯氏菌侵染過程中抑制細胞凋亡具有重要的意義。輔酶Q10和SLC3A2與VirB4特異結合的蛋白的表達量升高說明了其在布魯氏菌侵染滋養層細胞的過程中發揮作用，但具體生物學功能需進行更深入的研究。

本研究成功構建牛種布魯氏菌疫苗株RB51侵染牛胚胎滋養層細胞cDNA文庫；篩選出布魯氏菌疫苗株RB51的VirB4蛋白在侵染牛胚胎滋養層細胞過程作用的13種蛋白，并通過實時定量PCR檢測了特異結合蛋白輔酶Q10和SLC3A2的表達量在布魯氏菌侵染后都增加了；試驗中對VirB4蛋白與宿主細胞的互作研究為進一步闡明布魯氏菌感染宿主細胞的發病機制奠定了基礎。

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