2009-2012年寧夏人群感染布魯氏菌種型分布特征

高建煒，馬學平，韓 坤，張術斌

布魯氏菌病(Brucellosis，以下簡稱布病)是由布魯氏菌屬的細菌侵入機體，引起的人獸共患變態反應性疾病，是《中華人民共和國傳染病防治法》規定報告的乙類傳染病[1]。近年來我國動物間和人間布病疫情有回升勢頭。寧夏2004-2010年共報告布病病例509例，報告發病率0.017/10萬～3.141/10萬[2]，2010年對布魯氏菌病重點人群流行病學共調查3 977人，篩檢出血清陽性者145人，感染率3.65%，吳忠市感染率、患病率均高于其他市、縣[3]。本研究對寧夏2009-2012年間現癥病人血液中分離布魯氏菌，并對可疑菌株利用傳統方法結合分子生物學方法鑒定，發現了近年寧夏人群感染布魯氏菌主要種型分布。

1 材料和方法

1.1材料 布魯氏菌104M疫苗株作為對照菌株由中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所提供，22株布魯氏菌均從寧夏鹽池縣、紅寺堡開發區、吳忠市利通區和銀川市西夏區布魯氏菌現癥病人血液中分離獲得。

1.2試劑與儀器 虎紅平板凝集抗原、試管凝集抗原、布魯氏菌診斷血清、單向特異性“A”和“M”血清、布魯氏菌噬菌體“Tb”和“Wb”和“Bk2”均由中國CDC傳染病預防控制所提供，均在有效期內使用。雙相血培養瓶購自法國bioMerieux,sa；AMOS 引物由北京賽百盛生物有限公司合成；DNA提取試劑盒、PCR試劑購自天根生化科技( 北京) 有限公司。S1000TM型基因擴增儀、Universal HoodⅡ凝膠成像儀BIO-RAD 公司生產；DDY-6C 型電泳儀北京六一廠生產。

1.3方法

1.3.1樣本采集與培養 無菌采集布魯氏菌病急性期( 或慢性感染急性發作期) 病人血液5 mL, 注入雙相血培養瓶中,混勻后置37 ℃恒溫培養箱中培養, 每隔1 d觀察1次, 有菌生長時挑出菌落轉種布氏瓊脂中培養傳代, 若液體渾濁也可將液體挑取1環接種于布氏瓊脂中。無菌生長時將液面輕輕傾斜, 使液面浸過固體培養基, 繼續培養至30 d ,若仍無菌生長, 采用分子生物學方法檢測BCSP31基因，PCR陽性培養瓶樣本繼續接種培養，陰性培養瓶樣本高壓滅菌后棄之。

1.3.2傳統方法鑒定布魯氏菌 根據培養特性、二氧化碳需要、菌落生長時間和形態觀察，革蘭染色和柯氏染色初步判定布魯氏菌。接種觀察硫堇、堿性復紅染料抑菌試驗，A、M和R單相特異性血清凝集試驗，Tb、BK2、Wb噬菌體裂解試驗鑒定布魯氏菌種型[1]。

1.3.3布魯氏菌基因組DNA提取 按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取基因組DNA(Lot#K0125)。

1.3.4BCSP31PCR鑒定布魯氏菌屬[4]PCR引物序列:

B4:5’-TGGCTCGGTTGCCAATATCAA-3’;

B5:5’-CGCGCTTGCCTTTCAGGTCTG-3。

PCR 反應體系:10×PCRBuffer 2.5 μL,dNTP 2 μL,引物各1 μL,Taq酶1 μL ( 2.5 U ),模板1 μL,去離子水16.5 μL。PCR 反應程序:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s,60 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,共35個循環;最后72 ℃延伸10 min, 4 ℃保存。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物,凝膠成像分析儀拍照。

1.3.5AMOS-PCR鑒定布魯氏菌種[5]AMOS-PCR引物和體系按參考文獻的方法進行。P1:5-GACGAACGGAATTTTTCCAATCCC-3’;P2:5’-AAATCGCGTCCTTGCTGGTCTGA-3’;P3:5’-CGGGTTCTGGCACCATCGTCG-3’;P4:5’-GCGCGGTTTTCTGAAGGTTCAGG-3’;P5:5’-TGCCGATCACTTAAGGGCCTTCAT-3’;P6:5’-CCCCGGAAGATATGCTTCGATCC-3’;P7:5’-GCGCCGCGAAGAACTTATCAA-3’;P8:5’-CGCCATGTTAGCGGCGGTGA-3’。

PCR反應體系:10×PCR Buffer 2.5 μL, dNTP 2 μL,引物各0.5 μL (10 pmol/ L) , Taq酶1 μL ( 2.5 U ),模板1 μL,去離子水14.5 μL。PCR反應程序: 93 ℃預變性5 min; 94 ℃變性1min, 60 ℃退火1.5 min, 72 ℃延伸1.5 min,共40個循環;最后72 ℃延伸10 min, 4 ℃保存。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物, 并用凝膠成像分析儀拍照。

2 結 果

2.1布魯氏菌培養特性 采用雙相血培養瓶培養血液中的布魯氏菌4～5 d，固相瓊脂上有細小菌落生長，菌落大小大約為0.5～1 mm，濕潤、圓形、隆起、表面光滑、邊緣整齊、無色透明。革蘭氏染色鏡檢為G-、紅色的短小桿菌，柯氏特異性染色為細砂狀散落的紅色短小桿菌。生長時間、菌落形態和染色特征均符合布魯氏菌的特征，同時培養結果表明分離菌株對CO2無依賴性。

2.2傳統方法鑒定布魯氏菌 利用布魯氏菌單項特異性血清A,M和R分別對22株分離株進行特異性血清凝集試驗，結果分離的22株菌均與A和M血清發生凝集反應，而與R血清未發生凝集反應；對分離株的染料抑菌試驗結果顯示，分離株在硫堇和堿性復紅培養基上生長良好；噬菌體裂解結果顯示，分離株不被噬菌體Tb、Wb裂解,但是能被噬菌體Bk2裂解，根據以上試驗結果，鑒定22株布魯氏菌均為羊種3型布魯氏菌。

2.3PCR方法在布魯氏菌分離和鑒定中的應用 采用PCR方法檢測雙相血培養瓶在固相上未生長而液相渾濁的樣本BCSP31基因，結果從部分樣品中擴增到223 bp的特異性條帶(圖1)，證明液相中可能存在布魯氏菌生長，對其液相進一步接種培養，分離到布魯氏菌3株。

利用基因組DNA提取試劑盒提取高濃度基因組DNA，采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果均能滿足PCR反應條件，電泳結果見圖2。基因組DNA經PCR擴增檢測，產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，所有菌株均擴增出223 bp的特異性條帶，陰陽性對照試驗成立，符合布魯氏菌擴增理論值，擴增結果見圖3。

圖1PCR檢測雙向血培養瓶液相布魯氏菌BCSP31基因Fig.1PCRdetectiononBCSP31genefrombloodculturebottle

M: Marker; 1-6: Positive; 7-9: Negative

圖2部分地方分離株基因組提取結果

Fig.2GenomicDNAextractionresultofsomestrains

M: Marker; 1-10: Strains bacteria

圖3地方分離菌株PCR檢測結果

Fig.3PCRresultofthestrains

M: Marker; 1-22: Strains bacteria; 23: Negative control; 24: 104M

2.4AMOS-PCR方法鑒定布魯氏菌 AMOS-PCR對22株分離株基因組進行擴增，PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳就檢測，所有菌株和104M疫苗株均擴增出2條特異性片段，其中22株分離株擴增片段大小為731 bp和178 bp，符合羊種布魯氏菌擴增結果，104M擴增出498 bp和178 bp，符合牛種布魯氏菌擴增結果，檢測結果見圖4。

圖4地方分離菌株AMOS-PCR檢測結果

Fig.4AmplificationresultsofstrainsbyusingAMOS-PCR

M: Marker; 1-22: Strains; 23: Negative control; 24: 104M

3 討 論

目前傳統方法還是鑒定布魯氏菌的金標準，本研究采用觀察菌落生長時間和形態染色、二氧化碳需要、染料抑菌試驗、單相特異性血清A、M和R凝集試驗和噬菌體裂解試驗等傳統方法對分離22株細菌鑒定為羊種生物3型布魯氏菌，但耗時較長，并且存在生物安全的風險。

Bricker 等[6]研究用PCR能夠區別牛種布魯氏菌與其他種布魯氏菌，之后又用 PCR方法將布魯氏菌牛種(1，2，4 型)、羊種(1，2，3 型)、豬種(1 型)、綿羊附睪種區分鑒別，并將該方法稱AMOS-PCR。近年來，國內各地不斷有布魯氏菌分離菌株報道，并利用PCR和AMOS-PCR方法對其進行輔助鑒定[7-9]結果采用傳統分型方法結合MLVA方法對布魯氏菌進行分型鑒定，可以增加鑒定工作的正確性。目前, AMOS-PCR在國內外被廣泛應用, 其鑒定結果與傳統方法符合率高, 羊種菌為100% ,牛種菌為80% ,豬種菌為90%,綿羊附睪種菌為100%[5]。本研究從2009至2012年共分離到布魯氏菌22株，利用傳統方法結合分子生物學方法對其進行了系統的鑒定，其中PCR檢測BCSP31基因，能夠確定布魯氏菌屬，AMOS-PCR檢測結果能夠確定布魯氏菌種。為了防止布魯氏菌漏檢，當固相無菌生長時，利用PCR檢測方法檢測雙相培養瓶中液相布魯氏菌基因片段，作為判斷液相培養基中是否有菌生長的指標，結果從固相上未生長而液相上生長的培養基中檢測到布氏菌PCR陽性6份，分離到布魯氏菌3株，說明PCR檢測靈敏度高于分離培養。

近年來，隨著畜牧業的發展，布病疫情有回升的勢頭，全國各地布病檢測陽性和患病率逐年上升[10]，寧夏布病疫情與全國一致，從2004-2010年的調查數據顯示，報告發病率從0.017/10萬上升到3.141/10萬，職業以農民居多，占69.94%，疫區范圍不斷擴大，地區分布不均衡，患者以男性青壯年為主[11]。2012年布病發病率達8/10萬以上，說明寧夏的布病疫情處在高發水平。寧夏上個世紀就開展了病原學監測工作，自1958年寧夏首次在軍馬場確診病人體內分離到羊種布魯氏菌后，到1989年該區共分離到布魯氏菌138株，包括4個種12個生物型，其中引起人體感染的主要種型為羊種布魯氏菌[12]，2009年寧夏開展布病病原學監測以來，主要菌型為羊種3型布魯氏菌，說明近期分離布魯氏菌種型與以往感染人體主要菌型一致。

參考文獻：

[1]Xiao DL. Brucellosis prevention manual[M]. 1sted, Beijing: People’s Medical Publishing House, 2008：1. (in Chinese)

肖東樓.布魯氏菌病防治手冊 [M].北京:人民衛生出版社，2008：1.

[2]Jin F, Song XJ, Hu XZ, et al. Epidemiological analysis of human brucellosis in Ningxia between 2004 and 2010[J]. Ningxia Med J, 2013, 35(1): 40-41. (in Chinese)

靳峰,宋曉佳,胡興中,等. 2004-2010 年寧夏人間布魯氏菌病病例流行病學特征分析[J].寧夏醫學雜志,2013, 35( 1):40-41.

[3]Jin F, Li L, Song XJ, et al. An epidemiology investigation of the brucellosis in key population of Ningxia in 2010[J]. J Ningxia Med Univ, 2013, 35(1): 49-51. (in Chinese)

靳峰,李麗,宋曉佳,等.2010 年寧夏布魯氏菌病重點人群流行病學現況調查分析[J].寧夏醫科大學學報,2013,35(1): 49-51.

[4]Ma XP, Gao JW, Qin YX, et al. Use of AMOS-PCR to identify species ofBrucellain Ningxia[J]. J Pathog Biol, 2010, 5(9): 652-654. (in Chinese)

馬學平,高建煒,秦迎旭,等.AMOS-PCR在寧夏布魯氏菌種型鑒定中的應用[J]．中國病原生物學雜志,2010,5(9):652-654.

[5]Jiang H, Cui BY, Zhao HY, et al. Use of AMOS-PCR assay for the species identification ofBrucella[J]. Chin J Zoonoses, 2009, 25(2): 107-109. (in Chinese)

姜海, 崔步云, 趙鴻雁,等. AMOS-PCR對布魯氏菌種型鑒定的應用 [J].中國人獸共患病學報, 2009, 25(2):107- 109.

[6]Bricker BJ, Ewalt DR, Olsen SC, et al. Evaluation of theBrucellaabortusspecies--specific polymerase chain re-action assay, an improved version of theBrucellaAMOS polymerase chain reaction assay for cattle[J]. J Vet Diagn Invest, 2003, 15(4): 374-378.

[7]Zhang HF, Wang H, Yan ZL, et al. Etiological diagnosis of the first case of brucellosis in Tongxiang[J]. Dis Surveill, 2013, 28(1): 47-49. (in Chinese)

張紅芳，王衡，嚴卓琳，等. 浙江省桐鄉市首例布魯氏菌病原學診斷病例調查[J].疾病監測，2013,28(1):47-49.

[8]Wang YZ, Chen CF, Cui BY, et al. Isolation and identification ofBrucellamelitensisbiovar 3[J]. Chin J Prev Vet Med, 2007, 29(10): 753-755. (in Chinese)

王遠志,, 陳創夫, 崔步云, 等. 羊種布魯氏菌生物3型的分離和鑒定[J].中國預防獸醫學報,2007,29(10):753-755.

[9]Mao LL, Yao WQ, Zhang X, et al. Molecular identification of oneBrucellacanisstrain isolated in Liaoning[J]. Dis Surveill, 2012, 27(5): 385-399. (in Chinese)

毛玲玲，姚文清，張旭，等. 遼寧省1株犬種布魯氏菌分離株的分子生物學鑒定[J]. 疾病監測，2012,27(5): 385-399.

[10]China CDC. China’s major infectious diseases and pest monitoring report[M]. Beijing: China CDC, 2010: 187-194. (in Chinese)

中國疾病預防控制中心.中國重點傳染病和病媒生物監測報告[M].北京:中國疾病預防控制中心, 2010：187-194.

[11]Sun CE, Zhang D, Tang CM, et al. Epidemiological survey of brucellosis in Ningxia[J]. Ningxia Med J, 1994,16(1): 41-46. (in Chinese)

孫承恩,張鐸,唐昌茂,等.寧夏布魯氏菌病流行病學調查研究[J].寧夏醫學雜志,1994,16(1):41-46.