中國南方地區馬爾尼菲青霉分子流行病學初步研究

趙 亮，唐秀文，王梅竹，曹 煜，牟麗麗，金 方，李小玲，陳玉如，康穎倩

馬爾尼菲青霉菌 (Penicilliummarneffei，PM)主要侵犯免疫受損的人群，引起馬爾尼菲青霉病(penicilliosis marneffei，PSM)。該病主要在東南亞地區流行，如泰國、越南、柬埔寨、老撾、香港等，在流行地區，馬爾尼菲青霉菌病已成為繼結核病和隱球菌性腦膜炎之后的第三大機會性感染，并已成為東南亞國家HIV感染的指征性疾病[1]。我國以廣西、廣東地區多見，但近年來，兩廣以外的省份也出現感染病例。為了進一步探索該真菌在不同地區的分布特點及分子流行病學特點。本文采用了微衛星基因分型法(multilocus microsatellite typing，MLMT)對貴州及廣西、廣東地區的馬爾尼菲青霉菌臨床株進行了分型和對比研究。

1 材料與方法

1.1菌株來源 通過貴州省貴陽市傳染病院HIV感染科，廣西壯族自治區龍潭醫院檢驗科，廣州孫逸仙醫院等從貴州省，廣西省，廣東省各地區病人血液、皮膚分泌物中分離馬爾尼菲青霉菌菌株共50株，其中貴州省16株，廣西省29株，廣東省5株。

1.2培養基和試劑 PDA培養基(Difco Laboratories)，CTAB(四川金山制藥公司)，PCR試劑盒(Fermentas公司)，Taq-DNA 多聚酶(上海生工)。

1.3菌株分離與形態學鑒定 將貴州收集到的標本及獲贈自廣西、廣東的菌株接種于PDA培養基上，37 ℃培養，劃線法分離純化馬爾尼菲青霉菌，挑取單個菌落傳代保存，分別于25 ℃及37 ℃觀察馬爾尼菲青霉菌的菌絲相及酵母相形態特點。

1.4DNA提取 將50株馬爾尼菲青霉菌接種于PDA培養基，37 ℃培養72 h，收集培養物，采用玻璃珠法和CTAB法[2]提取馬爾尼菲青霉菌的DNA，吸光度法檢測DNA濃度，并稀釋成1 μg/μL冷凍備用。

1.5ITS檢測與鑒定 以ITS4、ITS5為引物，用PCR試劑盒在25 μL反應體系中擴增，上、下游引物及DNA各1 μL，反應條件為預變性94 ℃ 5 min，然后變性94 ℃ 30 s、退火50 ℃30 s、延伸72 ℃1 min循環35次，最后72 ℃延伸10 min，將產物于1.5%瓊脂糖中電泳后在紫外燈下觀察，并將擴增產物進行測序。

1.6微衛星基因分型

1.6.1引物合成 根據文獻[3]，選擇具有6個以上二核苷酸重復單位的微衛星位點AL684924 ( PMMI),AL686035 ( PMMII), AL684847 ( PMMIII)，合成引物，每對引物上游5’端用6-羧基熒光素(FAM)標記。

1.6.2微衛星序列分析 用合成的3對引物對50株PM基因組DNA分別進行擴增。50 μL PCR反應體系為，DNA模版4 μL，引物0.2 μmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，10×PCR緩沖液5 μL，Taq-DNA 多聚酶2.5 U，MgCl22 mmol/L。PCR反應條件，96 ℃預變性4 min，然后變性95 ℃30 s、退火58 ℃30 s、延伸72 ℃30 s循環35次，最后72 ℃延伸30 min，將產物于1.5%瓊脂糖中電泳后在紫外燈下觀察。擴增樣品冷凍送于上海生工公司進行毛細管電泳，通過Genescan軟件分析計算等位基因大小。根據序列長度，分離株可被分為不同基因型。

1.7聚類分析 應用SPSS18.0軟件聚類分析法處理等位基因數據，自動生成譜系聚類樹狀示意圖。

2 結 果

2.1菌株分離與觀察 貴州共分離到16株，以及獲贈自廣西地區的29株及廣東的5株，共50株馬爾尼菲青霉菌，37 ℃培養72 h形成乳白色酵母型菌落，25 ℃培養72 h形成青綠色絲狀菌落，并產生酒紅色色素(圖1)。

圖1PDA培養基上的馬爾尼菲青霉菌菌落

Fig.1ColoniesofP.marneffeionPDAsolidmedium

a:P.marneffeicolonies (yeast form) growing at 37 ℃ for 72 hours;

b:P.marneffeicolony (filamentous form) growing at 25 ℃ for 72 hours

2.2ITS序列分析 將ITS序列測序結果在Pubmed 基因庫中搜索對比，鑒定菌種，結果顯示所收集菌株均為馬爾尼菲青霉菌。

2.3微衛星分型 結果顯示50株馬爾尼菲青霉菌的每個位點均可以觀察到一個簡單的PCR擴增產物，說明培養物中沒有混雜的PM菌株。PCR產物大小用Genescan軟件分析，如圖2所示，藍色主峰即為標記的等位基因大小。

微衛星引物PMMI 、PMMII、PMMIII分析檢測到的等位基因見表1，50個樣本共檢測到47個微衛星型(PMMT)。貴州檢測到14個型，相同型別的菌株有Gypm2、Gypm3和Gypm15，均屬于PMMT2型；廣州檢測到4個型，相同的有Sums0851、Sums0107,均屬于PMMT18型；廣西檢測到29個型。如圖3A所示，PMMI區分度最高，共檢測到29個不同大小的等位基因,散在分布于158～245 bp內，分布頻率最高的是192 bp和189 bp的等位基因，各有6株(各為12%)，其中含192 bp等位基因的菌株于3個地區都有分布，而含189 bp等位基因的菌株均來自貴州。PMMII檢測到9個不同的等位基因，分布在148～158 bp之間，如圖3B所示，分布頻率較高的等位基因型是150 bp、149 bp和153 bp,分別有16(32%)、13(26%)和10(20%)株，3個地區共有的等位基因是148 bp和153 bp。PMIII檢測到8個不同的等位基因，分布在213～225 bp內，如圖3C所示，分布頻率最高的是218 bp、216 bp和214 bp，分別有17(34%)、16(32%)和9(18%)株，其中216 bp和218 bp是三個地區共有的等位基因。

圖2馬爾尼菲青霉菌Sums0851毛細管電泳圖

Fig.2CapillaryelectrophoresispatternsofP.marneffeistrainSums0851

A: PMMI; B: PMM II; C: PMMIII

圖350株馬爾尼菲青霉菌的等位基因在貴州、廣西和廣東地區的分布特點

Fig.3Alleledistributioncharacteristicsfor50P.marneffeistrainsobtainedfromGuizhou,GuangxiandGuangdong

A: PMMI; B: PMMII; C: PMMIII

表1 PM菌株來源地理區域、等位基因大小、微衛星分型

根據歐式距離 ( Euclidean distance )[4]可將貴州、廣西、廣東臨床分離的馬爾尼菲青霉菌分為6大類(Cluster1～ Cluster6)，譜系聚類樹狀圖如圖4所示，Cluster1共9株(18%)，包括3株廣東株和6株廣西株；Cluster2共8株(16%)，均為廣西株；Cluster3共27株(54%)，包括13株貴州株、13株廣西株和1株廣東株；Cluster4共3株(6%)，包括1株貴州株和2株廣西株；Cluster5共2株(4%)，為貴州株和廣東株各1株；Cluster6僅1株(2%)貴州株。

圖450株馬爾尼菲青霉菌的聚類分析樹狀圖

Fig.4Phenogramtreeconstructionwith50P.marneffeistrains

Strains named Gypm- obtained from Guizhou; strains named Sums- obtained from Guangxi; strains named Gxpm- and A00- obtained from Guangxi.

3 討 論

馬爾尼菲青霉菌是一種溫度依賴性雙相真菌，在37 ℃生長形成酵母樣菌落，在25 ℃生長形成絲狀菌落，并產生酒紅色色素。竹鼠是該菌的天然宿主，有研究[5]認為竹鼠是該病重要的傳染源，也有[6]推測接觸流行區的含菌土壤可引起人感染，具體傳播途徑尚待明確。在我國最早以廣西省最多見[7]，近年來，隨著艾滋病的增多，PM引起的感染在云南、北京、福建、四川等省相繼出現報道，且呈上升趨勢。說明我國PM感染逐漸跨越了原來的流行區域，但相關分子流行病學研究尚存不足。早期應用于PM分子流行病學研究的RFLP、RAPD等[8-9]方法，區分度較低，重復性較差。目前微衛星序列分型法(MLMT)以其高度多態性和高分辨率被廣泛應用于群體遺傳學和分子流行病學分析中。Fisher等[10]用23個微衛星位點對來自不同流行國家的PM臨床分離株進行分析，提示PM的地區分布與種群基因結構存在相關性。Lasker和Ran等[3]應用3個微衛星位點對流行地區PM的相關研究也獲得相似推論。為進一步了解PM的流行特征，本研究通過對來自我國南方地區貴州、廣東和廣西的馬爾尼菲青霉菌臨床菌株微衛星多態性研究，以從微生態遺傳基因層面揭示該菌的分子流行病學特點及其與地域間的聯系。

本研究共收集并鑒定了來自貴州、廣西和廣東的馬爾尼菲青霉臨床株50株。AL684924 (PMMI)、AL686035 (PMMII)、AL684847 (PMMIII)3個微衛星位點分別檢測到29、9和8種不同大小的等位基因，組合3個基因將50株PM分為47個微衛星型(PMMT1～PMMT47)。說明貴州、廣西和廣東分布的馬爾尼菲青霉存在著較高的基因多態性。進一步分析各微衛星位點在3個地區的分布，發現PMMI集中在158～245 bp之間，分布以189 bp(12%)和192 bp(12%)比例最高，PMMII集中在148～158 bp之間，分布以150 bp(32%)、149 bp(26%)和153 bp(20%)為主，PMMIII集中在213～225 bp內，分布以218 bp(34%)、216 bp(32%)和214 bp(18%)為主，對比還發現3個地區間微衛星位點均存在相同的等位基因分布。而根據等位基因聚類分析結果，3個地區PM臨床株分為6類，其中54%屬于Cluster3，Cluster1和Cluster2分別占18%和16%，Cluster4 、Cluster5 和Cluster6分布較少。以上結果分析顯示貴州、廣東和廣西的馬爾尼菲青霉微衛星型具有一定的地區分布規律和相關性，這可能與貴州、廣東和廣西都位于我國南方地區，且位置鄰近有關，本研究結果再次說明馬爾尼菲青霉的種群基因結構與地域分布之間存在著一定的相關性。但這種相關性是否與相鄰地區間菌株遷徙以及地區間的疾病傳播有關，則需擴大樣本量及采樣范圍進一步研究。另外，我們還在同一地區內發現了相同的微衛星型和個別分布比較特殊的等位基因(如含PMMI 189 bp等位基因的菌株均來自貴州)，這是否意味著PM的分布還存在地區同源性和遺傳差異性，均有待于補充更多標本后進一步研究明確。

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