雞源腸炎沙門氏菌對抗菌藥物的耐藥性分析

陸 彥，呂 安，趙紅玉，侯曉林，吳國娟

沙門氏菌是一種重要的人獸共患病原菌，它不僅能夠引起家禽的各種疾病，并且能夠通過污染的禽肉造成人類沙門氏菌感染，直接威脅人體健康[1]。國內外由于沙門氏菌造成的食物中毒和食源性疾病案例一直排名前列[2]。長期以來，在農業和畜牧業中大劑量不合理的使用抗菌藥物導致沙門氏菌的耐藥性日趨嚴重，耐藥菌株不斷增加，耐藥譜逐年變寬，耐藥機制越來越復雜。相關監測數據表明，整個沙門氏菌屬的多重耐藥率已從20世紀90年代的20%～30%增加到了本世紀初的70%[3]。張秀麗等[4]對2006-2007年河南省生肉食品中121株沙門氏菌進行了12種抗生素的藥敏試驗，總體上受試菌株對12種抗生素均表現耐藥。Biendo等[5]對51株人員鼠傷寒沙門氏菌的耐藥情況調查表明，90%以上的菌株對磺胺類藥物、氨芐西林、鏈霉素和四環素耐藥。腸炎沙門氏菌是沙門氏菌屬致病血清型之一，目前國內關于腸炎沙門氏菌耐藥性研究較少。鑒于此，本試驗從山東省部分地區不同場所采集沙門氏菌，對分離出的沙門氏菌株進行藥物敏感性試驗和耐藥基因檢測，了解該地區沙門氏菌耐藥情況，為臨床用藥提供依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1培養基及藥品 亞硒酸鹽胱氨酸增菌液(SC)、MH肉湯、科瑪嘉沙門氏菌顯色培養基購自北京奧博星生物技術有限公司。氨芐西林、四環素、磺胺異惡唑、萘啶酸等抗菌藥物標準品購自中國獸藥監察所。

1.1.2菌株 試驗用沙門氏菌從山東省部分地區的雞孵化場、養殖場和屠宰場中采集，在中國山東省農科院畜牧所分離。雞白痢沙門氏菌標準菌株CVCC533、鼠傷寒沙門氏菌標準菌株CVCC541、大腸桿菌ATCC25922購自中國獸藥監察所。

1.2方法

1.2.1菌株分離、鑒定和血清分型 將樣品置于無菌亞硒酸鹽胱氨酸(SC)增菌液中37 ℃恒溫培養12～24 h，增殖培養液劃線接種于科瑪嘉沙門氏菌顯色培養基37 ℃恒溫培養24 h后觀察菌落形態特征，紫色邊緣整齊的單個菌落判定為疑似沙門氏菌。菌株純化培養后通過PCR方法檢測分離株invA基因[6]，陽性菌株確認為沙門氏菌。

采用寧波天潤60種沙門氏菌屬診斷血清，通過玻片凝集法對沙門氏菌進行血清型鑒定，根據Kauffmann-White抗原表檢索沙門氏菌血清型。雞白痢沙門氏菌標準菌株CVCC533和鼠傷寒沙門氏菌標準菌株CVCC541為陽性對照，生理鹽水為陰性對照。

1.2.2藥物敏感性試驗 采用臨床實驗室標準化委員會(CLSI)[7]推薦的微量肉湯稀釋法對分離株進行19種臨床常用抗菌藥物的MIC值測定，測試的藥物為：氨芐西林、阿莫西林-克拉維酸、頭孢噻呋、頭孢唑啉、達氟沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、萘啶酸、氟苯尼考、氯霉素、磺胺甲惡唑、磺胺異惡唑、甲氧芐啶、四環素、多西環素、多粘菌素、卡那霉素、阿米卡星、慶大霉素。以大腸桿菌ATCC25922做藥敏試驗質控菌，結果判定參照CLSI標準。

1.2.3PCR擴增和序列分析 根據藥敏試驗結果，參照GenBank中登陸的耐藥基因序列及相關文獻[8-9]設計合成引物，擴增Ⅰ型整合酶基因和3′-保守端基因，其引物見表1。另外設計合成了12對引物，分別擴增萘啶酸、青霉素類、四環素類耐藥基因，PCR引物序列及大小見表2。PCR反應體系總體積為20 μL，包括模板DNA l μL；10 nmol/L的上下游引物各1 μL；雙蒸水7 μL和2×PCR Mix10 μL。PCR 擴增條件見表3。采用凝膠試劑盒回收、純化耐藥基因的PCR擴增產物，進行序列測定，并與GenBank中的相應耐藥基因序列進行同源性分析。

1.2.4脈沖場凝膠電泳(PFGE) 用限制性內切酶XbaI將雞孵化場、養殖場和屠宰場同時攜帶有Ⅰ型整合酶基因、3′-保守端基因、blaTEM和tetA的菌株進行DNA染色體消化分解，根據美國Pulse Net標準實驗室規程推薦的CHER Mapper脈沖場凝膠電泳系統對其進行凝膠電泳。以Salmonellaserovar Braenderup H9812作為PFGE相對分子質量的標準菌株。電泳結果使用Bio-rad公司的Info Quest FP(Version 4.5)軟件進行圖像分析和數據處理。

表1 沙門氏菌整合子的PCR引物序列

表2 沙門氏菌耐藥基因的PCR引物序列

表3 PCR反應運行參數

2 結 果

2.1細菌的分離鑒定 本研究從山東省部分地區雞孵化場、養殖場、屠宰場3個來源992個樣品中分離出178株腸炎沙門氏菌，分離率為17.94%。陽性腸炎沙門氏菌在孵化場中分離率最高為58.08%(115株)；雞養殖場中分離率為9.58%(23株)；雞屠宰場中分離率為7.22%(40株)，見表4。

表4 不同來源沙門氏菌分離率

2.2藥敏試驗 從藥物敏感性實驗結果看出(見表5)，腸炎沙門氏菌耐藥情況比較嚴重，在178株分離株中，100%的菌株對萘啶酸/磺胺甲惡唑產生耐藥性，為19種供試抗菌藥物中最強。耐磺胺異惡唑的腸炎沙門氏菌株比例為88.76%、氨芐西林為68.54%、四環素為66.85%、甲氧芐啶為64.61%、多西環素為34.27%、阿莫西林-克拉維酸為33.71%、頭孢噻呋和頭孢唑啉均為7.3%、氯霉素為5.62%、達氟沙星為3.37%、卡那霉素、諾氟沙星為2.25%、恩諾沙星和多粘菌素為1.12%。腸炎沙門氏菌對氟苯尼考、慶大霉素、阿米卡星比較敏感，耐藥率均為0.56%。

表5 腸炎沙門氏菌耐藥率

2.3耐藥基因檢測 125株青霉素類耐藥的菌株中有110株檢測到blaTEM基因，檢出率達到88%，沒有擴增出blaPSE基因。其中120株具有氨芐西林耐藥表型的菌株中112株攜帶blaTEM基因，占93.3%；124株四環素類耐藥的菌株中有102株檢測到tetA基因，檢出率為82.25%。未檢測到tetB、tetC、tetD和tetG基因；178株腸炎沙門氏菌株中有86株檢測到IntⅠ，檢出率為48.3%。所有IntⅠ基因陽性菌株均擴增到了3′-保守端基因；萘啶酸耐藥菌株中檢測到5株攜帶qepA基因，未檢測到qnrA、qnrB、aac(6′)-Ib-cr、qnrS基因(見表6)。

表6 含耐藥基因的菌株數與耐藥菌株數的比較

2.4脈沖場凝膠電泳 挑取不同場所耐藥菌株進行脈沖場凝膠電泳，通過PFGE分析產生14-17條帶，條帶分子量大小范圍在20～1 100 kb之間。從圖1中可以看出，通過軟件的聚類分析，不同場所分離的10株腸炎沙門氏菌可以分為4個型(同源性80%以下)，其中分離自同一場所的腸炎沙門氏菌呈現基本相同的PFGE譜型，如來自孵化場的C76、C58；來自屠宰場的MHY2、507、251；也有分離自不同養殖場的腸炎沙門氏菌呈現較為接近的親緣關系，如來自孵化場的C76、C58和屠宰場的MHY2、507、251；另外，同一場所不同PFGE譜型的有養殖場分離株:43、34、L3。

圖110株腸炎沙門氏菌的PFGE圖譜

Fig.1PFGEpatternoftenstrainsofSalmonellaenteritidis

Chicken hatchery: C76, C58, C135; Chicken farm: 43, 34, L3; Slaughterhouse: MHY2, MHJY, 507, 251; Marker:SalmonellaH9812.

3 討 論

本次研究中我們從山東省部分地區雞孵化場、養殖場和屠宰廠采集沙門氏菌樣品，經分離、鑒定其主要血清型為腸炎沙門氏菌，這與大多數國家所分離到的優勢血清型基本一致。美國和歐盟2010年從肉雞中分離的沙門氏菌主要以腸炎、肯塔基血清型為主[10-11]；楊保偉等[12]對陜西省2007-2008年部分零售畜禽肉沙門氏菌血清型研究顯示，雞肉源沙門氏菌以腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌為主。值得注意的是，此次研究中腸炎沙門氏菌在雞孵化場弱雛中分離率很高，達58.08%。由此可以看出腸炎沙門氏菌是山東省雞孵化場中正在盛行的高致病性沙門氏菌血清型，很可能是弱雛的致死菌。

從藥敏試驗結果看，本次研究中大部分沙門氏菌對氨芐西林和四環素產生了較高的耐藥性。趙愛華等[13]對2010-2011年江蘇泰州周邊地區分離的腸炎沙門氏菌進行藥物敏感性檢測發現腸炎沙門氏菌對氨芐西林和四環素的耐藥率分別為74.2%和64.5%，與本研究結果基本一致。廖成水等[14]的研究中氨芐西林和四環素的耐藥率分別為61.22%和19.39%，明顯低于本實驗結果，分析原因可能與菌株來源、不同地區用藥情況、飼養管理等方面有密切關系。

細菌的耐藥機制是復雜的，其遺傳機制主要是由耐藥基因直接編碼蛋白或基因作用位點發生突變[15]。目前研究表明，細菌對四環素類抗菌藥物的耐藥主要是由于獲得了有關結合質粒或轉座子中新的四環素耐藥基因tet。tet種類繁多，已鑒定出30多種，其中tetA、tetB、tetC、tetD、tetG[16]等在沙門氏菌中發生率較高。Peirano[17]和Fan[18]等分別對135株沙門氏菌和107株革蘭氏陰性菌進行分析，菌株四環素耐藥主要由tetA和tetB介導。本研究中124株四環素類耐藥的菌株中有102株檢測到了tetA，與以上報道相似，沒有發現tetB、tetC、tetD和tetG，tetA檢出率為82.25%，說明tetA在山東省部分肉雞生產場所廣泛流行 。

細菌對青霉素類抗菌藥物產生耐藥性主要是由于產生β-內酰胺酶，從而水解β-內酰胺類抗菌藥物酰胺環上的酰胺鍵。β-內酰胺酶家族包括的酶類相當廣泛，根據基因來源和進化關系可分為TEM型、SHV型、CTX型和OXA型等。目前，從沙門氏菌中檢測到的β-內酰胺酶耐藥基因有blaTEM、blaPSE、blaSHV、blaOXA、blaCTX-M等[16]。本次研究中我們從110株青霉素類耐藥的菌株中擴增到blaTEM基因，檢出率達88%，比廖經忠等[19]報道的142株革蘭氏陰性腸桿菌blaTEM檢出率為59.9%這一結果要高，說明blaTEM廣泛流行于山東省雞源腸炎沙門氏菌中，且青霉素類耐藥主要由blaTEM基因介導。

細菌耐藥問題已經成為一個世界性的難題，研究山東省食源性沙門氏菌的藥敏性特征及與耐藥性產生的相關基因，有助于從食物鏈的源頭和食品性動物生產中采取合理的干預措施，減少和防止沙門氏菌耐藥性的產生，保障食品安全。同時，也對更好的了解沙門氏菌的耐藥機理和有效控制日趨嚴重的沙門氏菌耐藥性問題提供了依據。

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