熱休克蛋白90與不良妊娠結局的相關性研究

于湄 張雪玲 孟艷岑 范玉香

近年來，不良妊娠的發生率越來越高，對于不良妊娠的影響因素眾說紛紜，包括妊娠期高血壓、肥胖、過度緊張、年齡較高等，而對于其發生機制尚無定論。熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)是所有生物細胞在應激原刺激后，發生熱休克反應時產生的一類細胞伴侶蛋白的總稱。研究證實，HSP對于腫瘤細胞的分化及凋亡的調控有重要作用。本課題以不良妊娠患者為研究對象，觀察比較正常妊娠組及不良妊娠組孕婦外周血及胎盤組織中HSP90的表達情況，為探討熱休克蛋白90與不良妊娠發生的關系，試圖探索不良妊娠期發病機制，以便為更好的防治本病，降低不良妊娠奠定理論基礎

1 資料與方法

1.1 一般資料2009年10月至2010年10月在我院住院分娩的孕婦共170例，年齡22～34歲，平均年齡28.85歲，所有病例均為單胎初次分娩，無基礎疾病:(1)正常妊娠組:共70例，體重60～90 kg，平均73 kg，足月順產，未出現不良母嬰并發癥;(2)不良妊娠組:共100例，體重62～89 kg，平均73 kg，出現妊娠期高血壓疾病、甲功異常、早產、胎膜早破、胎兒生長受限等母嬰不良妊娠結局。2組一般資料有均衡性。

1.2 方法

1.2.1 外周血及胎盤組織標本采集:所有研究對象晨起空腹采肘靜脈血2 ml。將采集到的血液標本置入不含抗凝劑的試管中，混勻，待血液完全凝集后4℃條件下3 000 r/min離心10 min，取上清液置于另一個無菌不含抗凝劑的試管中，-80℃保存待測。在胎盤娩出后，立即切取指腹大小的胎盤組織，包于無菌錫箔紙中，-80℃保存待測。

1.2.2 ELISA檢測外周血血清中HSP90的含量:在酶標檢測儀上，以空白對照孔調零后，在450 nm處分別讀出各孔的OD值，經酶標儀內置分析軟件，以OD值為縱坐標，以標準品濃度為橫坐標，自動繪制標準品曲線。根據各孔待檢測樣品(血清)的OD值可在標準曲線上查出其相應的濃度。

1.2.3 Real-time PCR檢測胎盤組織中HSP90 mRNA的含量:Real-time PCR試劑購自大連TAKARA生物科技有限公司，嚴格按照試劑說明書進行實驗操作。根據Primer5.0軟件設計引物序列。HSP90引物序列為:上游引物(5’-3’):GATAAGGCAGTTAAGGACC，下游引物(5’-3’):ATAGATGCGGTTGGAGTG;以 βactin作為內參，上游引物(5’-3’):GAGACCTTCAACACCCCAG，下 游 引 物(5’-3’):GCCATCTCTTGCTCGAAGTC;引物交由大連TAKARA生物科技有限公司合成。采用二步法進行熒光定量PCR，先進行95℃，30 s的熱啟動，再進行95℃，5 s的預變性，然后進行60℃，20 s 40個循環PCR反應，每個循環結束收集熒光，根據熒光強度繪制擴增曲線。95℃30 s，55℃30℃，95℃30 s，5～95℃每隔0.3度收集熒光，根據熒光強度經換算生成熔解曲線，進行質量控制。

1.3 統計學分析 應用SPSS 16.0統計軟件，計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05認為有統計學差異。

2 結果

2.1 外周血血清中HSP90的含量 正常妊娠組與不良妊娠組外周血中HSP90水平分別為(0.6±0.4)ng/ml，(1.6±0.4)ng/ml。2組比較差異有統計學意義(P＜0.05)。

2.2 胎盤組織中HSP90mRNA的含量 正常妊娠組與不良妊娠組胎盤組織中HSP90含量分別為(1.15±0.03)，(3.89±0.78)。與正常妊娠組相比，不良妊娠組胎盤組織中HSP90水平明顯高于正常妊娠組(P＜0.05)。

3 討論

HSP是所有生物細胞在應激原刺激后，發生熱休克反應時產生的一類細胞伴侶蛋白的總稱。HSP90是熱休克蛋白家族中的重要成員之一，是存在于真核生物和細菌中的一種基本的重要分子伴侶，是細胞內最活躍的分子伴侶蛋白之一，作為特異分子伴侶的HSP90參與多種信號途徑中的激酶和核受體家族、P53等轉錄因子活性的調節，在細胞生長發育、分化、蛋白質合成、折疊運輸和分解、細胞骨架的功能、膜功能以及應激條件下對細胞的保護等生理代謝中起著重要的生物學作用。HSP90通過與100多種底物蛋白質相互作用，參與調控和維持多種蛋白的構象和作用，對細胞內許多生物過程如細胞生長、分化和凋亡都有重要作用［1］。機體遭受組織損傷、病原微生物感染、炎性細胞因子等均可引起HSP的過量表達，以維持細胞的正常功能。

有研究提示，HSP90在妊娠期高血壓組、輕度子癇前期組、重度子癇前期組胎盤中的蛋白和基因表達明顯強于正常組，且呈逐漸加強的趨勢［2］。不良妊娠的發生是多種因素作用，其具體機制尚不明確。HSP90參與細胞周期的調控，通過腫瘤研究發現HSP90活性被抑制后可以使乳腺癌細胞株停滯在G1期，而且這種阻滯的發生依賴于細胞內Rb的表達，并最終會導致細胞分化或凋亡［2，3］，因此，HSP90對細胞周期的調控具有重要作用。本研究中，不良妊娠組胎盤組織及外周血中HSP90的表達明顯高于正常妊娠組，提示HSP90可能參與了不良妊娠的發生過程，具體機制尚待進一步的研究。

近年來研究發現，HSP90高表達與惡性腫瘤的發生有關，它能與細胞內的一些輔分子伴侶結合成不同的多蛋白復合體，并通過維持期“受體蛋白”，如Akt、Raf-1、HER-2/nen等的穩定和活性間接地調控細胞內多條與細胞增殖、分化、存活以及凋亡有關的信號傳導通路，其獨特的性質使其成為抗腫瘤治療的良好靶點，認為其抑制劑為有希望的抗癌治療藥物［2-4］。HSP90能與活化蛋白激酶C受體競爭性結合HIF-1α，從而使其免于非氧依賴方式的降解以維持其穩定，并影響低氧時低氧誘導因子的核轉位、與HIF-1β的異二聚化及轉錄活性等，進而抑制其細胞凋亡。HSP是一種應激蛋白，廣泛存在于人、動物、微生物內。有研究表明，通過檢測血清中HSP70，可間接反映疾病與熱休克蛋白之間相互作用的關系［4］。妊娠期高血壓疾病時升高的血清HSP70不僅僅來源于胎盤組織的釋放，亦來自疾病嚴重時累及其他臟器時機體的應激反應［4］。隨HELLP程度加重，血清HSP70含量越高，因此血清HSP70含量在HELLP診斷、療效觀察及衡量疾病嚴重程度方面具有重要的臨床價值［5］。

劉彥霞等［6］研究發現，與正常者相比，在胎盤血管病患者中HSP70表達明顯增高，提示HSPs高表達引起了內在免疫應答及炎性反應，參與胎盤血管病的發生機制。另外，HSP90伴侶分子的干擾可引起Pnck誘導的EGFR降解，從而干擾新生血管的形成［7］。Rangaraju等［8］研究發現，HSPs在神經病學模型中可以誘導髓鞘的發生，說明HSPs可以參與神經系統的發育;Luo等［9］通過實驗也發現，HSP90β同樣參與了乙酰膽堿受體的構建及穩定。本研究發現，不良妊娠結局如妊娠期高血壓疾病、胎兒生長受限患者其血清及胎盤組織中HSP90的含量明顯高于正常妊娠，且與疾病的嚴重程度呈正相關，說明其在不良妊娠的發生、發展過程中有一定作用。研究表明，妊娠期高血壓疾病的發病機制是由于滋養細胞浸潤不足減少子宮胎盤灌注，導致胎盤缺血缺氧，誘發生物活性因子的釋放，導致血管效應而產生血壓升高［9］。在胎兒生長受限時，子宮螺旋動脈壁出現大量泡沫細胞，即急性粥樣硬化現象，因而導致子宮胎盤血流量降低，導致低氧狀況，出現胎盤功能不良，從而影響胎兒的生長及發育。機體細胞受到各種應激刺激如缺氧、缺血，感染等刺激的情況下會釋放多肽，同時攜帶具有免疫原性的多肽，產生免疫反應，這些因素有可能增加HSP90的表達，進而致使循環中HSP90水平增高。HSP90參與了胎兒的生長發育的某些重要過程，其與不良妊娠結局的發生關有一定關系，其具體機制尚需進一步研究。

1 Zhao R，Houry WA.Molecular interaction network of the Hsp90 chaperone system.Adv Exp Med Biol，2007，594:27-36.

2 Strethapakdi M，Liu F，Tavorath R，et al.Inhibition of Hsp90 function by ansamycins causes retinoblastoma gene product-dependent G1 arrest.Cancer Res，2000，60:3940-3946.

3 Munster PN，Srethapakdi M，Moasser MM，et al.Inhibition of heat shock protein 90 function ansamycins causes the morphological and functional differentiation of breast cancer cells.Cancer Res，2001，61:2945-2952.

4 趙勇，耿素敏，張瑞清，等.妊高癥患者血清熱休克蛋白70水平的表達及意義.中國衛生檢驗雜志，2009，19:135-136.

5 耿素敏，趙勇，嚴真真.血清熱休克蛋白70在重度子癇前期合并HELLP綜合征中的價值探討.中國醫藥導刊，2009，11:2100-2101.

6 劉彥霞，徐健，王欣.熱休克蛋白70與胎盤血管病中內皮激活的相關研究.實用婦產科雜志，2010，26:222-226.

7 Deb TB，Zuo AH，Wang Y，et al.Pnck induces ligand-independent EGFR degradation by probable perturbation of the Hsp90 chaperone complex.Am J Physiol Cell Physiol，2011，300:C1139-1154.

8 Rangaraju S，Madorsky I，Pileggi JG，et al.Pharmacological induction of the heat shock response improves myelination in a neuropathic model.Neurobiol Dis，2008，32:105-115.

9 Luo S，Zhang B，Dong XP，et al.HSP90 beta regulates rapsyn turnover and subsequent AChR cluster formation and maintenance.Neuron，2008，60:97-110.