Survivin與甲狀腺腫瘤及凋亡指數的研究進展

巨濤 劉寧青

·綜述與講座·

Survivin與甲狀腺腫瘤及凋亡指數的研究進展

巨濤 劉寧青

survivin；甲狀腺腫瘤；凋亡指數

細胞凋亡(Apoptosis) 是一種由基因調控的高度保守的細胞主動死亡過程，這一過程受到一系列促凋亡蛋白及抑制凋亡蛋白的精確調控。細胞凋亡異常是許多惡性腫瘤顯著的生物學特征[1]。甲狀腺癌(Thyroid carcinoma TC)是最常見的頭頸部及內分泌系統惡性腫瘤，Survivin 是迄今為止最小的凋亡抑制蛋白家族的新成員。研究顯示， Survivin對凋亡的抑制可能是其參與甲狀腺癌發生的重要機制[1]。細胞凋亡指數(apoptotic index AI)作為近年來評價腫瘤細胞凋亡發生程度的一項指標，已普遍用于各種腫瘤中凋亡的檢測。本文就survivin與甲狀腺癌及其凋亡指數的研究現狀做簡要綜述。

1 survivin的分子生物學

1997年耶魯大學的Ambrosini等[2]利用效應細胞蛋白酶受體-1(effector cell protease receptor-1,EPR-1) cDNA 在人類基因組文庫中首先克隆出Survivin基因。其是迄今為止最小的凋亡抑制蛋白家族的新成員，卻具有最強大的抗凋亡作用。人類的Survivin基因定位于染色體17q25，由約15×103個堿基對組成，基因全長14700bp，由4個外顯子和3個內含子組成。其與EPR-1 基因的編碼區序列高度互補，二者不同的是Survivin與EPR-1方向相反，序列上有5個核苷酸與EPR-1不同， 以及有額外6個插入的核苷酸。

Survivin基因外顯子和內含子不同的選擇性剪切片段能夠轉錄出大量不同的剪接變體mRNA，進一步編碼出不同的蛋白[3]。目前發現的Survivin剪接變體有五種：Survivin 野生型，Survivin-2α，Survivin-2β，Survivin-3β，Survivin-ΔEx3。其在細胞中主要存在于細胞核和細胞質，近期在線粒體也發現了Survivin的存在。Survivin3β和SurvivinΔEx3 均有抗凋亡特性。有研究顯示，Survivin2β的缺失可導致腫瘤細胞的侵襲性增強，這提示了Survivin2β可能作為天然的具有抗凋亡活性拮抗物而存在。Survivin2α可以與Survivin 結合并且拮抗Survivin的活性，這提示了Survivin2α可能起著調節Survivin 活性功能的作用。Zheng等[4]從乳腺癌細胞系B-cap37 中鑒定了最新的人類的Survivin剪接異構體Survivin-image(SI)，并認為其可能與腫瘤發生有密切關系。

Survivin蛋白在已克隆出的8個細胞凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis protein,IAP)成員中分子量最小，結構也非常獨特。其是由142 個氨基酸組成的蛋白質， 相對分子質量為16.5 kD。對蛋白的光衍射晶體結構分析表明， Survivin蛋白晶體結構呈廣泛二聚體排列[5]。而與其它IAP 成員結構的主要區別在于：(1)Survivin 僅含有單個桿狀病毒IAP重復序列(baculovirus IAP repeat,BIR)，而其它IAP 成員均包含2-3 個BIR；(2)Survivin 存在一個由Cys-Pro-Thr 三氨基酸組成的插入片段，將BIR 分成兩個等分模塊，這一插入片段是Survivin所特有的；(3)Survivin C- 末端含有一個由40 個氨基酸組成、長度6.5 nm的疏水α 螺旋卷曲結構， 缺乏IAP 家族成員特有的鋅指結構(zinc finger ring)；(4)BIR序列和α螺旋結構間的連接區域具有核輸出信號功能， 該信號的突變可引起survivin 抗凋亡與有絲分裂調控作用的分離[6]。

2 survivin的功能及作用

2.1 survivin與細胞凋亡 細胞凋亡主要有內源性因素導致的線粒體通路和外源性因素導致的死亡受體通路。目前認為，Survivin發揮抗凋亡作用可能是兼具以上兩種通路，而其中可能存在多種途徑。 主要有兩條:(1)Caspase 途徑:抑制凋亡信號轉導的上游通路caspase8及caspase9；抑制下游的效應Caspase 3及caspase7的活化；促進IAP 家族其他成員的功能,間接發揮抗凋亡作用。(2)非Caspase 途徑:通過p21 間接抑制Caspase；通過抑制p53的功能阻斷凋亡過程；通過對紡錘體微管的作用調節細胞有絲分裂過程,進而發揮抗凋亡功能,survivin的這一特性是在所有已知的凋亡調節物中獨一無二的。

2.2 survivin與細胞周期 Survivin是一種具有雙重作用的蛋白質。除具有抑制細胞凋亡的作用外，還通過干擾CDK和微管網絡影響細胞有絲分裂從而促進細胞存活。其表達有嚴格的細胞周期依賴性，主要在G2/M 期表達[7]，是細胞周期G2/M 期的調節基因。Survivin 過表達可減少胞質中中心體微管成核和有絲分裂紡錘微管雙向增長[8]從而促進轉化細胞異常增殖，并避免腫瘤細胞凋亡的發生。

有學者用Survivin反義寡核苷酸轉染Hela 細胞， 產生大量多倍體細胞和微核的子細胞， 細胞有絲分裂失敗， 細胞凋亡。而在有絲分裂初期， 用抗Survivin 抗體作用于上述細胞， 則染色單體分離異常，過早分離， 不均勻分離，甚至形成腫瘤細胞。因而證實， Survivin 在有絲分裂過程中發揮非常重要的作用。用微管抑制劑干預Survivin與微管之間的相互作用，可以導致Survivin 抗凋亡活性的喪失以及caspase3 的激活，從而引起細胞凋亡。

2.3 survivin與血管生長 1971年Folkman提出,腫瘤侵襲性生長和轉移的形態學基礎是新生血管的生成，其核心是血管內皮細胞的分裂增殖， 2000年Papapetropoulos等報道， Survivin參與了機體組織中血管的生成， 可能是血管形成中生長因子誘導的保護性基因， 維持血管內皮細胞的正常增殖。

應用血管內皮生長因子(VEGF)和堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)誘導靜止期的內皮細胞分裂，血管內皮細胞內Survivin含量提高了16倍。 Ma等[9]發現VEGF 可上調survivin mRNA 的表達， 應用VEGF 受體抑制劑(VEGFTKR)可使survivin 基因的表達明顯下調。因此,抑制survivin 的表達能通過VEGF 通路的阻斷間接促進腫瘤血管的凋亡性退化，抑制腫瘤生長。

2.4 survivin抗體 Survivin在腫瘤組織中高表達，而在成人終末分化組織中低表達或不表達， 因此腫瘤患者機體免疫系統將視Survivin 蛋白為非己蛋白而產生免疫反應， 并可在其血液中檢測到循環抗體。人類癌癥能夠誘導機體產生免疫反應，這使血清自身抗體成為癌癥檢測的非常有前景的標志物。用酶聯免疫吸附試驗和免疫印跡技術在肺癌和結直腸癌患者血清中檢測到抗survivin 抗體，研究發現76.4%(42/55)的頭頸腫瘤血清樣本中抗survivin 抗體陽性，而且晚期病例中檢測到了高水平的表達[10]。Eto 等[11]研究顯示，頭頸腫瘤血清中抗survivin 抗體的陽性率為64.7%～77.8%，總陽性率為71.1%(69/97)。

3 Survivin在常見腫瘤組織中的表達及其與凋亡指數的研究

survivin 廣泛表達于人類腫瘤細胞系，Tamm 等采用了NCI 抗腫瘤藥物篩選程序中的60 種人類腫瘤細胞株，研究了survivin 在體外培養細胞的表達。結果發現,60 種人類腫瘤細胞株均有survivin 的表達，不同癌組織Survivin 表達陽性率不同，如胃癌為48.12%，結直腸癌為63.15%，肝癌為70%，乳腺癌為70.17%，胰腺癌為76.19%～88%， 間皮瘤為100% 。

凋亡指數(AI)是衡量組織中細胞凋亡發生程度的一項指標。TdT介導的脫氧尿苷酸缺末端標記法(Terminal deoxy-transfer asemediated dUTP nickend lableling,TUNEL)是目前最常用的檢測凋亡細胞方法,屬于原位DNA3′-末端標記法的一種。通過常見腫瘤中的表達及其與凋亡指數的關系可以看到，survivin 在結、直腸癌患者總體表達率約為53.2%～63.5% ，其陽性表達與凋亡指數降低密切相關，在bcl-2 陰性而僅有survivin 表達陽性時即可引起凋亡指數顯著降低。在乳腺癌患者中， 有70.7% survivin 表達陽性， 其表達與凋亡指數的降低顯著相關， 而凋亡指數較低者其生存率顯著低于凋亡指數較高者， 這一結果提示，survivin 的表達可以作為預后較差的標志。survivin 在胃癌中有34.5% 呈不同程度表達，其表達獨立于p53 和bcl-2 的陽性表達， 而與凋亡指數呈顯著負相關。

4 survivin在甲狀腺腫瘤中的表達及其與凋亡指數的研究

研究表明，甲狀腺癌的發病率以每年3%的速度遞增[12]。它的發生約占全身惡性腫瘤的1%，在神經內分泌系統惡性腫瘤中占90%以上。證明Survivin對凋亡的抑制可能是其參與甲狀腺癌發生的重要機制。

Ito等[13]采用RT-PCR法研究了甲狀腺腫瘤中Survivin 的表達，在濾泡狀腺瘤、 濾泡狀癌、乳頭狀癌中Survivin 的表達率為分別為11.1% (2/18)，19.0% (4/21)，22.5%(16/71)，而且Survivin的表達與臨床分期有關，而在未分化型甲狀腺癌中Survivin的表達率高達84.2% (16/19)，強烈提示Survivin的表達與甲狀腺癌的組織學分型有關。

Antonaci等[14]通過免疫組織化學對67例巨大甲狀腺乳頭狀癌患者(其中37例并發微小癌的患者)的癌組織和淋巴結轉移灶細胞進行survivin蛋白檢測，發現在同一患者巨大乳頭狀甲狀腺癌組織和微小癌組織中的表達水平沒有明顯差異。在有侵襲轉移的病人中其癌組織和淋巴結轉移灶survivin蛋白的表達水平明顯增高。

項丞等[15]應用免疫印跡法及RT-PCR技術研究98例甲狀腺癌及癌旁組織中Survivin 的表達，結果顯示兩種方法測得甲狀腺癌組織Survivin表達率均為68.37%，在癌旁組織中survivin均沒有表達。其陽性表達率與病理分型、淋巴結轉移、血行轉移密切相關(P<0.05)。同時應用TUNEL法測定這些組織的凋亡指數，結果survivin表達陽性組AI顯著低于陰性組AI(P<0.01)，提示survivin表達可抑制甲狀腺細胞的凋亡，這可能是其參與甲狀腺癌發生的重要機制。

錢婀娜等[16]取62例甲狀腺病變標本，包括結節性甲狀腺腫 及良惡性甲狀腺腫瘤組織。分別應用 TUNEL法及免疫組化技術對凋亡指數、細胞增殖核抗原增殖指數(PCNA-LI,PI) 和Survivin 蛋白的表達進行檢測。測得甲狀腺癌中Survivin 蛋白表達率61.90%，遠高于良性組織中5.00 %的表達率。其陽性表達率與淋巴結轉移和臨床分期有關(P<0.05)。 且Survivin 蛋白表達陽性組和陰性組的AI 和PI 均呈負相關，2組間AI 和PI 的差異均具有統計學意義(P<0.01) 。

Sugawara等[17]應用免疫組化法研究了6例甲狀腺淋巴瘤和6例橋本甲狀腺炎中Survivin mRNA 與端粒酶逆轉錄酶(hT-ERT mRNA) 的表達，結果甲狀腺淋巴瘤survivin mRNA 水平高于橋本甲狀腺炎,免疫組化染色證實甲狀腺淋巴瘤的淋巴樣細胞有著豐富的survivin 蛋白的表達。hTERT mRNA 定量不能鑒別二者。因此， 在組織學上難以鑒別時， Survivin mRNA 可作為鑒別甲狀腺淋巴瘤和橋本甲狀腺炎的指標。

Zhou[18]通過RT-PCR和免疫組化這兩種技術測定90例甲狀腺腫瘤中survivin的表達，結果兩種方法測得survivin在甲狀腺癌中的表達率分別為89.3%和86.7%，均遠遠高于其在甲狀腺良性腫瘤中的表達(P<0.01)。同時發現survivin在惡性程度越高且存在淋巴結轉移組織中具有更高的表達(P<0.05)，而其表達與年齡、性別、組織學亞型和病理階段無統計學意義。他們還通過小干擾RNA(small inter-fering RNA,siRNA) 研究其對survivin的抑制作用，結果顯示survivin在腫瘤中的表達明顯降低，也說明siRNA可能成為潛在的治療甲狀腺癌的方法。

許珂玉等[19]利用RNAi技術沉默Survivin 基因， 研究其對甲狀腺癌細胞增長的抑制作用，結果顯示,RNAi 組的細胞凋亡指數明顯高于其它各組(P<0.01)。細胞增殖主要被阻斷在增殖周期的G0/G1期，而其它各組間沒有顯著性差異。說明了RNAi 作用在增殖早期就起作用，并能夠有效地阻斷survivin 的表達， 促使細胞發生凋亡， 達到類似基因敲除的效果。因此survivin 基因或可作為甲狀腺癌基因治療的新靶點。

Du等[20]利用免疫印跡及RT-PCR技術研究20例甲狀腺髓樣癌及正常甲狀腺組織中survivin的表達。survivin在甲狀腺髓樣癌中的表達率為80%(8/10),而正常組織中survivin沒有表達(0/10)，且其陽性表達率與其他臨床病理特征無相關性(P>0.05)。同時他利用反義寡核苷酸技術揭示Survivin 反義寡核苷酸能夠顯著下調survivin mRNA及蛋白的表達，誘導甲狀腺癌細胞凋亡，抑制細胞增殖。

目前對于survivin 的研究正在逐步深入，其在腫瘤的發生發展、轉移、復發、預后、治療及早期診斷中均表現出一定的意義。隨著對survivin的深入研究， 腫瘤發生發展機制進一步闡明， 這可能對惡性腫瘤的臨床診斷與治療具有潛在的重大價值。

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050051 石家莊市，河北醫科大學普通外科2011級研究生(巨濤)；河北醫科大學第三醫院普通外科(劉寧青)

劉寧青，050051 河北醫科大學第三醫院普通外科；

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2014-02-25)