遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌的分子病理研究

聶 辰 李月廷▲ 趙保健 高 磊 閆 瑾 王俊懿

1.北京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院外科，北京 100039；2.北京德博全基因檢測技術(shù)研究所，北京 100097；3.北京京蒙高科干細(xì)胞技術(shù)有限公司，北京 100085

遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌（hereditary nonpolyposis colorectal cancer，HNPCC）是由于錯(cuò)配修復(fù)基因（mismatch repair gene，MMR）發(fā)生種系突變所導(dǎo)致的一種綜合征。 Henry Lynch 最早描述了遺傳性癌癥綜合征的臨床特征[1]，故而HNPCC 又稱為Lynch 綜合征。HNPCC 的特征為結(jié)腸癌和其他腫瘤（如子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、胃癌、小腸癌、肝膽系統(tǒng)腫瘤、上泌尿道腫瘤、腦部腫瘤和皮膚癌等）發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)較高。 自1990 年起，HNPCC 國際合作組織及許多國家發(fā)布了多個(gè)HNPCC 家族的臨床篩選標(biāo)準(zhǔn)[2-5]，我國也于2004 年發(fā)布了中國人遺傳性大腸癌的篩檢標(biāo)準(zhǔn)[6]。 多年來的臨床實(shí)踐和研究表明，臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)難以兼顧敏感性和特異性，將漏診錯(cuò)診大量病例[7]。因此我國在發(fā)布家系篩選標(biāo)準(zhǔn)的同時(shí)，還發(fā)布了分子病理的篩檢策略，以彌補(bǔ)臨床篩檢策略的不足，包括MLH1 和MSH2 的免疫組化檢測、MSI 檢測和基因測序等[6]。

目前國內(nèi)外公認(rèn)MMR 基因外顯子測序?yàn)樵\斷HNPCC 的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于成本高、耗時(shí)長、技術(shù)難度高，不利于其推廣應(yīng)用。 有研究報(bào)道免疫組化檢測MMR 基因突變的敏感性（77%～97%）及特異性（89%～100%）均較高[8]，能夠直接反映出MMR 蛋白表達(dá)情況，且在全國各大醫(yī)院均可開展，因此通過免疫組化篩查HNPCC 患者是一種行之有效的方案[9]。 本課題通過對(duì)北京地區(qū)94 例結(jié)直腸癌患者的腫瘤組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，觀察MLH1、MSH2、MSH6 及PMS2四個(gè)MMR 基因的蛋白表達(dá)情況，研究北京地區(qū)住院人群HNPCC 的分子病理特征，評(píng)估北京地區(qū)住院人群HNPCC 的發(fā)病情況。

1 材料與方法

1.1 材料來源

94 例結(jié)直腸癌組織標(biāo)本均采集自2012 年3～9 月于北京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院及解放軍總醫(yī)院住院接受手術(shù)治療并經(jīng)病理確診為結(jié)直腸癌的患者。

1.2 免疫組化

1.2.1 試劑與儀器 MLH1 和MSH2 一抗購自Novocastra 公司，MSH6 和PMS2 一抗購自Epitomics 公司。光學(xué)顯微鏡購自奧林巴斯公司，型號(hào)為CX31。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法 采用免疫組織化學(xué)的方法檢測腫瘤組織內(nèi)MLH1、MSH2、MSH6 及PMS2 蛋白的表達(dá)。 操作步驟如下：將腫瘤組織蠟塊連續(xù)切片（厚度約4 μm），放入70℃烤箱烤片1 h。 梯度脫蠟：二甲苯脫蠟3 次各10 min；無水乙醇脫蠟3 次各5 min；95%乙醇脫蠟2 次各2 min；80%乙醇脫蠟2 min。 自來水、蒸餾水沖洗各20 s。 放入3%過氧化氫水溶液10 min。 自來水、蒸餾水沖洗各20 s，放入PBS 緩沖液中。 組織修復(fù)采用高溫高壓法：待高壓鍋內(nèi)修復(fù)液沸騰后，放入切片，蓋緊高壓鍋蓋，待高壓鍋閥門噴氣開始計(jì)時(shí)，修復(fù)時(shí)間為2 min。修復(fù)液為pH 8.0 的EDTA 緩沖液。切片取出后放入PBS 緩沖液中充分洗滌3 次，每次3 min。取出切片，擦干組織周圍液體后滴加一抗，放入4℃冰箱內(nèi)過夜。切片放入PBS 緩沖液中清洗3 次，每次3 min，充分洗滌。 滴加二抗，室溫孵育20 min。 切片放入PBS緩沖液內(nèi)洗滌3 次，每次3 min，充分洗滌。 進(jìn)行DAB顯色。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核。分化、返藍(lán)。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.3 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

參照Friedrichs 等[10]的免疫組化評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，采用半定量積分法，分別觀察染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞所占百分?jǐn)?shù)。 在40 倍鏡下連續(xù)觀察10 個(gè)視野，先按染色強(qiáng)度計(jì)分（染色深淺需與背景著色相對(duì)比），0 分為無色，1 分為淺黃色，2 分為棕黃，3 分為棕褐色。 再按陽性細(xì)胞占所觀察細(xì)胞的百分比打分，0 分為陰性，1 分為陽性細(xì)胞≤10%，2 分為陽性細(xì)胞＞10%～50%，3 分為陽性細(xì)胞＞50%～80%，4 分為陽性細(xì)胞＞80%。將染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分比計(jì)分相乘，乘積≥2 分為蛋白表達(dá)正常（陽性），乘積等于1 分為蛋白低表達(dá)（弱陽性）、乘積等于0 分為蛋白表達(dá)缺失或蛋白表達(dá)異常（陰性），蛋白低表達(dá)和蛋白表達(dá)缺失均按陰性表達(dá)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。陽性對(duì)照為內(nèi)部核染色陽性的良性腸上皮和（或）淋巴細(xì)胞。 結(jié)直腸癌組織中至少有一種MMR 蛋白表達(dá)為陰性，即發(fā)生突變，則將該患者定義為HNPCC 患者。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均應(yīng)用SAS 8.2 統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

在94 例結(jié)直腸癌組織中，至少有一種錯(cuò)配修復(fù)基因表達(dá)為陰性的（即HNPCC 患者）共有13 例，占13.83%。 MLH1 蛋白表達(dá)為陰性的有3 例，占HNPCC患者的23.08%；MSH2 蛋白表達(dá)為陰性的有11 例，占84.62%；MSH6 蛋白表達(dá)為陰性的有2 例，占15.38%；PMS2 蛋白表達(dá)為陰性的有1 例，占7.69%。 MSH6 蛋白表達(dá)陰性的2 例均伴有MSH2 蛋白表達(dá)陰性。PMS2 蛋白表達(dá)陰性的1 例同時(shí)伴有MLH1 和MSH2蛋白表達(dá)陰性。 見表1。

表1 13 例MMR 蛋白表達(dá)異常的結(jié)果

3 討論

國際癌癥研究機(jī)構(gòu)公布的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示[11]，2008 年全世界有1270 萬人患癌癥，760 萬人死于癌癥。 2009 年，我國結(jié)直腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)在男性中排第4 位，在女性中排第2 位[12]。 結(jié)直腸癌是一種有遺傳傾向的腫瘤，世界每年新發(fā)的結(jié)直腸癌病例中，約15%是家族性的，約10%是遺傳性的[9]，HNPCC 是最常見的一種遺傳性結(jié)直腸癌，占每年新發(fā)病例的2%～5%[9]。本研究結(jié)果顯示，在北京地區(qū)住院治療的94 例結(jié)直腸癌患者中，有13 例表現(xiàn)出MMR 蛋白表達(dá)缺失， 可診斷為HNPCC，發(fā)病率達(dá)13.83%，高于世界每年新發(fā)病例的水平。

HNPCC 主要由于MMR 基因發(fā)生種系突變所致。DNA 的MMR 基因系統(tǒng)能夠識(shí)別糾正DNA 復(fù)制過程中出現(xiàn)的堿基對(duì)錯(cuò)配和微小的插入或刪除。 MMR 基因的兩個(gè)家族MutS（MSH2、MSH3、MSH6）和MutL（MLH1、MLH3、PMS1 和PMS2）表達(dá)的蛋白形成異二聚復(fù)合體，協(xié)同作用介導(dǎo)修復(fù)錯(cuò)配DNA 的過程[13-14]。在此過程中，MSH2 起識(shí)別綁定錯(cuò)配DNA 的作用。MSH6 和MSH3 分別與MSH2 形成MutSα 和MutSβ復(fù)合體，募集MutLα（由MLH1 和PMS2 構(gòu)成）和MutSβ 復(fù)合體（由MLH1 和PMS1 構(gòu)成），介導(dǎo)錯(cuò)配基因識(shí)別和酶切修復(fù)過程。 因此，MLH1 蛋白和MSH2蛋白是構(gòu)成錯(cuò)配修復(fù)蛋白異二聚復(fù)合體的必備蛋白。盡管MSH6 蛋白和PMS2 蛋白表達(dá)缺失會(huì)影響錯(cuò)配修復(fù)蛋白異二聚復(fù)合體的構(gòu)成，但其他蛋白（如MSH3、MLH3 及PMS1 等）可與MLH1 蛋白或MSH2 蛋白結(jié)合，起到一定的代償作用[7]。

HNPCC 國際合作組織對(duì)來自全球500 多個(gè)HNPCC 患病家族的300 多個(gè)不同的致病基因突變的數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總統(tǒng)計(jì)，該基因突變數(shù)據(jù)庫顯示[15]：大多數(shù)的突變影響了MLH1 和MSH2 兩個(gè)基因，因?yàn)檫@兩個(gè)基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物是參與修復(fù)錯(cuò)配DNA 必不可少的成分；在所有MMR 基因突變中，MLH1 突變約占50%，MSH2 突變約占40%，MSH6 突變約占10%，而PMS2突變僅約占2%。 本研究的結(jié)果與該數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計(jì)信息相比，在北京地區(qū)住院的HNPCC 患者中，MLH1 基因突變比例相對(duì)較低，MSH2、MSH6 和PMS2 基因突變比例均相對(duì)較高，但僅有MSH2 基因突變所占比例的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。 在發(fā)生MMR 基因突變的13 例中，僅1 例為PMS2 突變，且與MLH1 和MSH2 同時(shí)突變，這與Gill 等[16]報(bào)道的PMS2 單獨(dú)突變率較低的結(jié)論相符。

MSH2 突變與HNPCC 的腸外腫瘤高發(fā)有關(guān)。Vasen 等[17]的研究表明，MSH2 突變基因攜帶者罹患子宮內(nèi)膜癌的風(fēng)險(xiǎn)（61%）比MLH1 突變基因攜帶者（42%）高，但差異不明顯；MSH2 突變基因攜帶者患泌尿道腫瘤、胃癌和卵巢癌的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)明顯增高。 在本研究中，MSH2 突變致病的比例高達(dá)84.62%，提示北京地區(qū)HNPCC 患者罹患腸外腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)較高。

本研究以免疫組化方法檢測MLH1、MSH2、MSH6 和PMS2 四種MMR 蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)北京地區(qū)住院的結(jié)直腸癌患者中，HNPCC 發(fā)病率高于世界每年新發(fā)病例的水平，且MSH2 基因突變致病尤為突出。 因此，在臨床上對(duì)HNPCC 應(yīng)高度重視，有效地篩查出HNPCC 患者[18-20]。

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