17-AAG 對人肝癌HepG2 細胞株增殖和凋亡作用的影響

陳美霓 郭 巍 趙菊梅 魏曉麗 王愛紅 龐秋霞

1.延安大學醫學院實驗中心，陜西延安 716000；2.延安大學醫學院附屬醫院泌尿外科，陜西延安 716000

原發性肝細胞癌是全球第5 位常見惡性腫瘤，其 病死率占惡性腫瘤病死率的第3 位。 據2008 年的報道，中國肝癌5 年患病數為29.6 萬例，約占全球肝癌5 年患病數的48.3%。 在未來10 年肝癌的發病數和病死數均將呈現上升趨勢。 采用手術切除等治愈方法僅適合10%～20%的肝癌患者，在5 年內復發率仍超過70%[1]。 所以尋找以腫瘤細胞特性為作用靶點的分子靶向治療有著特別重要的意義。 HSP90 抑制劑17-丙烯胺基-17-去甲氧格爾德霉素（17-AAG）對多種腫瘤細胞有抑制增殖、誘導凋亡的作用，但目前尚未見17-AAG 對肝癌細胞生長及凋亡影響的報道，本文探討17-AAG 對HepG2 細胞增殖、生長周期、誘導凋亡及對重組人血管內皮生長因子相關蛋白（VEGF-C）的表達進行初步探討，為17-AAG 治療肝癌的應用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌細胞株HepG2 由延安大學醫學院實驗中心提供。 RPMI-1640 培養基（賽默飛世爾公司），17-AAG、四甲基偶氮唑藍（MTT）及碘化丙啶（PI）（美國Sigma 公司）AnnexinV FITC 細胞凋亡檢測試劑盒（美國BD pharmingen 公司），RNase A 酶（德國Merck 公司），胎牛血清（美國Hyclone 公司），兔抗人VEGF-C蛋白、兔二抗及DAB 顯色劑（武漢博士德公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 取液氮保存的人肝癌HepG2 細胞在37℃恒溫水浴箱中快速復蘇，接種于內含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養液中常規培養，選取對數生長期細胞用于實驗研究。

1.2.2 MTT 法檢測細胞增殖能力 選取對數生長期的人肝癌HepG2 細胞用0.25%胰蛋白酶消化，加完全培養液制成單細胞懸液，以每孔為3×103個細胞接種于96 孔培養板中，置于37℃、5%CO2的培養箱中培養。培養24 h 后棄上清液，設無細胞孔作為空白組，不加藥孔為對照組，實驗組17-AAG 濃度為0.63、1.25、2.5、5.0 μmol/L，每組設5 個平行孔。分別溫育24、48、72 h后，每孔加入20 μL 濃度為5 mg/mL 的MTT 溶液，培養4 h，吸凈上清液，每孔加入150 μL 二甲基亞砜（DMSO），振蕩10 min，使用酶標儀測定波長為490 nm處的吸光度值，空白組調零。細胞增殖抑制率（%）＝（對照組OD 值-實驗組OD 值）/對照組OD 值×100%。 以上實驗結果重復3 次。

1.2.3 PI 染色觀察細胞核形態 人肝癌HepG2 細胞接種于內有重鉻酸鉀處理過的蓋玻片的24 孔板內培養。在細胞對數生長期時設對照組和實驗組培養48 h后終止，去上清液，用PBS 洗滌3 次，用50 μg/mL 的PI 熒光染液在4℃冰箱中避光染色20 min 后，夾出蓋玻片蓋在載玻片上，用熒光顯微鏡觀察細胞核形態并拍照。

1.2.4 流式細胞儀分析 取對數生長期的人肝癌HepG2 細胞接種于6 孔板內培養，設實驗組和對照組，培養48 h 后胰酶消化，用磷酸鹽緩沖液（PBS）離心洗滌2 次。 ①細胞周期：預冷70%酒精固定，4℃過夜，離心，棄去固定液，然后加入PBS 含50 μg/mL 的PI，100 μg/mL RNase A 酶，0.2%Triton X-100 染色液，微量振蕩器上振蕩混勻，4℃避光孵育30 min，200 目不銹鋼篩網過濾后流式細胞儀檢測。 ②細胞凋亡：嚴格按照AnnexinV FITC 細胞凋亡檢測試劑盒說明書步驟進行。 兩個實驗重復3 次。

1.2.5 VEGF-C 蛋白表達的檢測 將人肝癌HepG2 細胞接種于內有蓋玻片的6 孔板內培養培養，設對照組和實驗組培養48 h 后，4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗滌3 次，用中性樹膠將細胞面朝上固定于載玻片上，采用免疫組化鏈霉親和素-生物素復合物 （SABC）法染色，胰酶抗原修復，二氨基聯苯胺（DAB）顯色。兔抗人VEGF-C 稀釋比例為1∶100，以PBS 代替一抗作為陰性對照。 結果判斷：細胞胞漿出現棕黃色顆粒判斷為陽性細胞，按照Fromowit 等綜合計分法在高倍鏡下對染色細胞著色反應作結果判定。

1.3 統計學方法

采用統計軟件SPSS 17.0 對實驗數據進行分析，計量資料數據以均數±標準差（）表示，采用方差分析，行t 檢驗。 計數資料以率表示，采用χ2檢驗。 以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 17-AAG 對人肝癌HepG2 細胞生長的抑制作用

MTT 測定結果顯示，分別以0.63、1.25、2.5、5.0 μmol/L 4 個濃度的17-AAG 作用于人肝癌HepG2 細胞24、48、72 h 后，HepG2 細胞均有不同程度的抑制生長作用，各實驗組增殖抑制率與對照組比較，差異均有統計學意義（P ＜0.05）。其抑制作用經方差分析，具有劑量和時間依賴關系，差異均有統計學意義（P ＜0.05）。見表1。

表1 不同濃度的17-AAG 對人肝癌HepG2 細胞生長的抑制率（%，）

表1 不同濃度的17-AAG 對人肝癌HepG2 細胞生長的抑制率（%，）

注：與對照組比較，#P ＜0.05；17-AAG：17-丙烯胺基-17-去甲氧格爾德霉素

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2.2 PI 染色觀察凋亡細胞核形態變化

熒光顯微鏡下觀察17-AAG 不同濃度組48 h 后PI 染色下HepG2 細胞的形態變化（圖1）。 鏡下細胞核呈紅色熒光，對照組HepG2 細胞形態完整，細胞核大小一致，著色均勻；實驗組可見HepG2 細胞體積變小，細胞核固縮，呈濃縮強熒光，并隨藥物濃度升高，細胞數下降，凋亡小體逐漸增多。

圖1 熒光顯微鏡下HepG2 的細胞核染色質的形態變化（PI 熒光染色，100×）

2.3 17-AAG 對HepG2 細胞周期和凋亡的影響

流式細胞術分析顯示，HepG2 細胞在17-AAG 48 h 作用下，隨藥物濃度的增加，G2/M 期的細胞比例增加，提示17-AAG 能使HepG2 細胞阻滯在G2/M 期，PI 染色法檢測細胞周期分析結果顯示， 經17-AAG作用48 h 后，不同濃度的17-AAG 均能使細胞被阻滯在G2/M 期。 細胞周期阻滯作用亦隨藥物濃度增加而升高。 肝癌HepG2 細胞凋亡率隨著藥物濃度的增加明顯高于對照組細胞，與對照組比較差異有統計學意（P ＜0.05）。 見表2。

表2 17-AAG 對人肝癌HepG2 細胞周期和凋亡率的影響（%，）

表2 17-AAG 對人肝癌HepG2 細胞周期和凋亡率的影響（%，）

注：與對照組比較，＃P ＜0.05；17-AAG：17-丙烯胺基-17-去甲氧格爾德霉素

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2.4 免疫細胞化學染色法檢測VEGF-C 蛋白表達結果

免疫組織化學結果顯示，對照組HepG2 細胞VEGF-C 蛋白呈強陽性表達，棕黃色顆粒多，陽性細胞表達率高，見圖2A。17-AAG 作用HepG2 細胞48 h后，加藥細胞VEGF-C 蛋白與對照組比較，隨著17-AAG 濃度的增加，表達率及表達量呈逐漸降低趨勢。見圖2B～E。

圖2 17-AAG 處理HepG2 48 h 后VEGF-C 表達的影響（400×）

3 討論

肝癌是嚴重威脅著全球人類生命健康的疾病之一。近幾年，隨著腫瘤分子生物學研究的深入，分子靶向藥物已在多種腫瘤中進行廣泛研究和應用。 HSP90是一種高度保守的具有特殊分子伴侶的功能蛋白。HSP90 可以調節下游服務蛋白的穩定性[2]。 還參與多重信號通路的調控以及細胞周期進程，在致癌信號的傳導、血管的新生、抗細胞凋亡以及腫瘤轉移等方面有著重要的作用[3]。 抑制HSP90 可以消耗下游服務蛋白以及影響致癌的途徑，促進凋亡的發揮和抗腫瘤的效應[4]。實驗證實，HSP90 抑制劑17-AAG 對白血病[5]、乳腺癌[6]、多發性骨髓瘤[7]、前列腺癌[8]等腫瘤有治療活性，并與多數細胞毒試劑、蛋白酶體抑制劑、組蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制劑和新型靶向藥物聯用具有協同或增強的效果[9]。 17-AAG 通過與ATP 特異性競爭ATP/ADP 位點，使HSP90 構象改變導致效應蛋白失活，從而發揮其抑制生長，促進凋亡的作用[10]。 17-AAG還可誘導Flt3-ITD 的降解[11]，對有Flt3-ITD 的突變AML 患者有望改善其預后。 實驗MTT 結果表明，HSP90 抑制劑17-AAG 對肝癌HepG2 細胞有抑制生長的作用，抑制作用隨著作用時間、藥物濃度的增加而增強。通過PI 熒光染色，觀察到17-AAG 作用過的HepG2 細胞數減少，細胞核著色由大小均一變成體積小而深，并出現凋亡小體，提示17-AAG 對HepG2 細胞有抑制增殖并誘導凋亡的作用。本次試驗通過細胞流式檢測，提示17-AAG 的體外抑制可能與阻滯HepG2 細胞在G2/M 期，并促進凋亡有關。

血管內皮生長因子（VEGF）具有促進惡性腫瘤的增殖、侵襲和轉移的作用。 VEGF-C 是VEGF 家族中最早被發現的促淋巴管生成因子，與其受體VEGFR-3結合后促進淋巴管內皮細胞的生長，主要為三條通路：①VEGF-3 胞內的區酪氨酸Y1230/Y1231，發生自磷酸化、被識別、結合，通過誘導活化CRB2/ERX1/2和PI13K/AKT 信號通路，啟動DNA 復制，誘導內皮細胞增生；②VEGFR-3 酪氨酸殘基Y1063 發生磷酸化，誘導活化CRKⅠ/Ⅱ和c-Jun 氨基末端激酶Gnk1/2，引起細胞內信號級聯反應的信號； ③通過蛋白激酶C（PKC）依賴的p42/p44 MAPK 活化途徑和PI3K/AKT磷酸化產生的信號[12]。 VEGFR-3 通過與VEGF-C 結合后，還調節血管滲透性，促進腫瘤組織進入淋巴管，抑制凋亡，導致腫瘤的高轉移率的發生[13]。 有研究報道HSP90 抑制劑根赤殼菌素類可以抑制VEGF 的表達[14]，17-AAG 可以通過阻斷STAT3 通路抑制胃癌和乳腺癌細胞VEGF 的表達[15]。 本實驗研究結果表明，VEGF-C 在人肝癌HepG2 細胞對照組中處于高表達，一定劑量的17-AAG 可以明顯下調VEGF-C 蛋白的表達。 提示VEGF-C 蛋白參與了肝癌細胞增殖及轉移的相關生物學行為的調控，17-AAG 可以通過下調VEGF-C 蛋白的表達抑制淋巴管的生成，可能是17-AAG 抑制肝癌的機制之一。

總之，本次實驗證實了HSP90 抑制劑17-AAG能夠抑制肝癌HepG2 細胞的增殖，誘導凋亡，并通過下調VEGF 蛋白阻礙腫瘤的侵襲。由于17-AAG 發揮抗腫瘤的機制很多，還需進一步研究，為肝癌臨床上的應用提供實驗依據。

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