過氧化物酶增殖物激活受體-γ和核因子E2 相關因子-2在腎臟衰老中的作用

葉 婷 寧 勇

1.華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院臨床營養科，湖北武漢 430030；2.華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院腎內科，湖北武漢 430030

衰老是增齡過程中不可避免的結果，往往帶來多個器官功能受損。 腎臟是一個血供極其豐富的器官，在衰老過程中腎臟表現最為明顯。氧化損傷在人體衰老中發揮著重要作用。過氧化物酶增殖物激活受體-γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ）屬核激素受體超家族成員，除了具有調解脂質和糖代謝、抗炎調解免疫等重要生理功能，近來還發現其在維持氧化還原穩態方面具有重要意義。核因子E2 相關因子-2（nuclear factor-E2-related factor-2，Nrf2）是新近發現的又一個在氧化應激中起核心作用的轉錄激活因子。兩者是否也在腎臟衰老中發揮作用鮮有報道。 本文擬探討PPARγ 和Nrf2 在腎臟衰老氧化損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組及標本留取

選擇SD 雄性大鼠（華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心提供）20 只，常規條件下于實驗動物中心分籠飼養，保持12 h 的晝夜循環，室溫控制在23℃左右，濕度維持在40%～50%，自由進食水。將10 只大鼠飼養至3 個月齡（相當于成人20 歲）作為青年組，10 只大鼠飼養至24 個月齡（相當于成人80 歲以上）作為衰老組。斷頭處死放血干凈，生理鹽水沖洗腎臟。一側腎臟迅速縱切分割后，一半置于液氮保存，隨后-80℃保存留待蛋白質檢測中使用，一半留作病理檢查；對側腎臟立即制備組織勻漿。

1.2 方法

1.2.1 腎臟組織病理學分析 腎臟組織石蠟切片（2～3 μm）常規脫蠟入水，行PAS 染色，普通光鏡下觀察腎臟組織病理改變。

1.2.2 腎臟組織過氧化氫（H2O2）含量測定 腎臟組織勻漿按照H2O2檢測試劑盒（BioAssay System's peroxide assay kit，Hayward，CA））說明書進行。

1.2.3 腎臟組織丙二醛（MDA）測定 腎臟組織MDA 測定采用硫代巴比妥酸法（TBARS）檢測試劑盒（Cat#10009055，Ann Arbor，MI），操作參照說明書進行。

1.2.4 Western Blot 法 Western Blot 法檢測髓過氧化物酶（MPO）、Nrf2、PPARγ 的蛋白表達水平。分別提取總蛋白和核蛋白，操作參照說明書進行（T-PER?Tissue Protein Extraction Reagent 和NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents，Thermo Scientific）。 各組分別取總蛋白或核蛋白20 μg，進行十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），然后電轉移至0.22 μm PVDF 膜上。 5%的BSA 封閉1 h，用MPO（Abcam，ab22604，1∶5000）、Nrf2（Abcam，ab81445，1∶2000）和PPARγ（Santa Cruz，sc-25591，1∶2000）一抗4℃孵育過夜，用TBST 振搖洗膜10 min×3 次，以1∶5000 稀釋的羊抗兔生物素標記二抗，室溫孵育2 h后，再次用TBST 振搖洗膜10 min×3 次。 ECL 底物化學發光（Supersignal West Dura Kit，Thermo Scientific）顯色后機器掃描存盤，以Scion Image 軟件進行條帶分析。

1.3 統計學方法

采用SPSS 11.50 統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（）表示，兩組間比較采用t 檢驗；計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腎臟組織病理學改變

衰老組可見腎小管基底膜增厚皺縮，小管上皮細胞水腫、變性、壞死，部分小管囊狀擴張、萎縮，局灶性小管消失，間質增寬，炎癥細胞浸潤。病變嚴重區域可見系膜增生，節段性腎小球硬化。 見圖1。

圖1 腎臟組織病理改變（PAS×400）

2.2 腎臟組織H2O2、MDA 含量及MPO 蛋白表達情況

衰老組腎臟組織H2O2含量較青年組明顯升高[（239.90±39.38）μmol/μg 比（110.00±19.49）μmol/μg]，差異有統計學意義（P ＜0.05）。 衰老組腎臟組織MDA 含量較青年組亦明顯升高[（44.42±4.17）μmol/mg 比（26.23±1.43）μmol/mg]，差異有高度統計學意義（P ＜0.01）。與青年組相比，衰老組腎臟組織MPO 蛋白表達明顯升高，差異有高度統計學意義（P ＜0.01）。 見圖2。

圖2 腎臟組織氧化損傷指標檢測

2.3 腎臟組織Nrf2、PPARγ 蛋白表達

與青年組相比，衰老組腎臟組織Nrf2 蛋白表達無顯著性改變，差異無統計學意義（P ＞0.05）；而PPARγ表達則明顯下降，差異有高度統計學意義（P ＜0.01）。見圖3。

圖3 腎臟組織Nrf2、PPARγ 蛋白表達情況

3 討論

中國將是一個不可逆轉的老齡社會，伴隨老齡化的進程，慢性腎臟病逐年遞增。 老年腎臟病的有效防治已成為關系到我國民生的重要公共衛生問題。腎臟是衰老過程中人體器官變化最為明顯的器官之一，正常人在超過40 歲后腎小球濾過率平均每年下降1%，形態上表現為體積和重量下降，皮質相對萎縮、腎小球硬化等[1]。衰老是一個極為復雜的過程，受多種因素調控。 目前關于衰老的理論主要有自由基學說、線粒體DNA 損傷學說、端粒學說和衰老的基因學說等。早在1955 年，Harman 發表的“衰老的自由基理論”就提出，體內產生過多自由基是引起衰老的重要因素[2]。伴隨增齡，機體抗氧化防御酶體系清除自由基的能力下降，導致體內的自由基代謝紊亂。 自由基對機體組織細胞的損傷累積增加，最終導致組織器官形態機能老化，從而促使機體的衰老。

本研究采用24 個月齡衰老大鼠作為研究對象，比通常使用D-半乳糖造模更能真實反映衰老變化及其機制。 本研究發現，衰老組腎臟組織H2O2及MDA含量明顯增加，提示腎臟氧自由基的產生明顯增加。同時衰老組腎臟組織MPO 蛋白質表達也明顯升高，MPO 能催化反應生成過量的包括次氯酸在內的氧化劑。 這些均提示氧化損傷參與了腎臟衰老的發生，與以往（D-半乳糖造模）研究一致。

PPARγ 屬Ⅱ型核激素受體超家族成員，作為一種核受體，與所調控目的基因上游啟動子區的過氧化物酶增殖物反應元件（PPRE）結合后發揮對目的基因轉錄的調控作用，參與調節脂質和糖代謝，具有免疫調節、抗炎等功能。 PPARγ 還在維持機體氧化還原穩態方面具有重要作用[3-4]。在腎臟缺血再灌注大鼠模型中，PPARγ 激動劑匹格列酮能緩解彌漫性腎小管壞死和急性炎性反應，上調SOD1 表達，而下調p47phox和p67phox[5]。 在慶大霉素和順鉑導致的腎損傷中，PPARγ 激動劑均能上調超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）等抗氧化酶的表達，減少自由基產生，提高機體抗氧化能力，發揮腎臟保護作用[6-7]。 在高同型半胱氨酸誘導血管性癡呆大鼠模型中，PPARγ 激動劑可以改善學習、記憶功能，提高大腦中GSH 水平，減少自由基產生[8]。在體外衰老模型人二倍體成纖維細胞中，PPARγ 表達明顯下降。 而給予PPARγ 激動劑則能通過調節ERK1/2 通路減少H2O2誘導的細胞ROS 產生， 抑制ICAM-1、MMP-2、MMP-9 等炎癥因子表達[9]。 PPARγ調節氧化還原狀態的機制，一方面是對NF-κB 的抑制作用，另一方面是PPARγ 對機體抗氧化酶表達的直接調節作用。 以CAT 為代表的一些抗氧化酶的啟動子區具有PPRE，PPARγ 可以直接結合PPRE，誘導抗氧化酶的基因轉錄與翻譯[10]。 在本研究中發現，衰老組大鼠腎臟組織中PPARγ 表達明顯下調，因此可能導致其靶目標的抗氧化酶隨之表達不足，導致機體清除自由基的防御能力下降，從而導致腎臟衰老發生。

Nrf2 是新近發現的在氧化應激中起核心作用的轉錄激活因子，當受到來源于活性氧或親核劑的信號攻擊后，Nrf2 與其胞漿抑制蛋白Keap1 解離，轉位進入細胞核，與抗氧化反應元件（antioxidant response element，ARE）結合，并介導主要抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶，如NAD（P）H：醌氧化還原酶（NQO1）、谷胱甘肽S-轉移酶（GST）、GPx、谷氨酸半胱氨酸連接酶（GCL）和血紅素氧化酶（HO-1）等基因的轉錄活性。而抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶是機體清除自由基及內源性和外源性有害物質最主要的酶促系統。 因此，Nrf2 對于維持機體氧化還原平衡，應對氧化應激有關鍵性作用[11-12]。在衰老血管中，Nrf2 和SOD 表達下調同時，伴隨著輕度的炎癥狀態和血管舒張功能不全[13]。 在衰老小鼠的視網膜色素上皮細胞，給予氧化刺激后細胞Nrf2 不能保護性上調，從而導致多種抗氧化酶水平也不能隨之升高，細胞清除自由基功能下降[14]。 但在本研究中，衰老大鼠腎臟組織中Nrf2 表達無明顯變化。 提示腎臟衰老過程中抗氧化能力的減退并不是由Nrf2 通路介導。

本研究再次證實自由基過度產生所導致的氧化損傷在腎臟衰老中具有重要意義，而抗氧化防御系統功能減退可能由PPARγ 通路介導，而不是由Nrf2 通路介導，其具體的機制與作用還需進一步深入探討。

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