HPLC法同時測定復方甘草片中甘草苷、異甘草苷、甘草素、甘草酸

趙月然， 盧 丹

(大連市食品藥品檢驗所，遼寧 大連 116021)

復方甘草片[1]是臨床應用較廣的祛痰鎮(zhèn)咳藥，療效確切且經(jīng)濟實惠。其以甘草浸膏為主藥，甘草浸膏可以覆蓋在發(fā)炎咽喉黏膜上， 掩蓋局部感覺神經(jīng)末梢， 從而減少刺激，發(fā)揮止咳效應[2-3]。甘草據(jù)文獻報道[4-11]，甘草具有潤肺，解毒，調(diào)和諸藥的作用。甘草中的甘草酸和甘草黃酮是生物活性較強的物質(zhì)，現(xiàn)代藥理學研究表明甘草酸為皂苷類，在甘草中含有量較高，超過2%，其具有較強的保肝活性和腎上腺皮質(zhì)激素樣作用，可增強內(nèi)耳聽覺，能夠抗炎、抗變態(tài)反應、解毒止咳、抗腫瘤、影響脂質(zhì)代謝等作用。甘草中的甘草苷、異甘草苷、甘草素是甘草中重要的黃酮類化合物，具有抗?jié)儭⒖咕⒖寡住⒔獐d、鎮(zhèn)痛等作用。

《中國藥典》2010年版二部收載了復方甘草片中甘草酸定量測定，劉曉娜等[12]測定了復方甘草片中甘草酸、異甘草苷和異甘草素的量，楊紅娟等[13]同時測定了復方甘草片中嗎啡、磷酸可待因、甘草苷和甘草酸的量。本實驗采用超聲提取及高效液相色譜法同時測定復方甘草片中甘草酸、甘草苷、甘草素及異甘草苷的量，該方法簡單、準確、重復性好，為復方甘草片的質(zhì)量控制提供了有益的參考意見。

1 儀器與試藥

Agilent-1260型高效液相色譜儀，配置四元梯度泵、在線脫氣機、DAD檢測器；AS3120A超聲提取器(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；BP211D型、BP221S型電子分析天平(德國Sartorius公司)。

甘草苷對照品(批號111610-200604)，甘草酸單銨鹽對照品(批號110731-200614,98%)均購于中國藥品生物制品檢定所；甘草素對照品(批號20100603)購于天津一方科技有限公司；異甘草苷對照品(批號20101108)購于上海永恒生物科技有限公司。復方甘草片3批(東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司;批號 110911、111012、111113)。乙腈、甲醇為色譜純(美國MREDA公司)，

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Dikma Diamonsil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相為乙腈(A)-0.05%磷酸水(B),梯度洗脫(0～10 min，15%～25% A；10～20 min，25%～32% A；20～24 min，32%～34% A；24～30 min，34%～36% A；30～32 min，36%～42% A； 32～43 min，42%～51% A)；檢測波長為276 nm(0～16 min)、360 nm(16～24 min)、276 nm(24～28 min)、254 nm(28～38 min)；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。色譜圖見圖1。

1.甘草苷 2.異甘草苷 3.甘草素 4.甘草酸

2.2 對照品溶液的配制 精密稱取甘草苷、異甘草苷、甘草素、甘草酸對照品適量，分別加甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度分別為1.084 0 mg/mL、0.198 1 mg/mL、0.100 0 mg/mL、1.714 mg/mL的對照品貯備液，備用。分別加甲醇溶解，制成每1 mL分別含甘草苷54.20 μg、異甘草苷9.90 μg、甘草素10.00 μg、甘草酸171.4 μg的混合溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備 取復方甘草片20片，研細，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇100 mL(含1%氨水)，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率250 W，頻率45 kHz)30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%乙醇(含1%氨水)補足損失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關系的考察 分別精密量取“2.2”項下混合對照品溶液2、5、10、15、20 μL注入高效液相色譜儀，測定。以進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程，結果見表1。

表1 甘草苷、異甘草苷、甘草素和甘草酸回歸方程

2.5 精密度試驗 取復方甘草片粉末約0.5 g，精密稱定。按“2.3”項下供試品溶液制備的方法操作，在上述色譜條件下連續(xù)進樣6次，測得甘草苷、異甘草苷、甘草素、甘草酸的RSD值分別為1.6%、2.0%、2.2%、2.6%。結果表明,儀器精密度較好。

2.6 重復性試驗 取復方甘草片粉末6份，每份粉末約0.5 g，精密稱定。按“2.3”項下供試品溶液制備的方法操作，在上述色譜條件下進樣，測得甘草苷平均含有量為3.53 mg/g(RSD=1.1%)、異甘草苷平均含有量為1.56 mg/g(RSD=2.4%)、甘草素平均含有量為0.38 mg/g(RSD=2.9%)、甘草酸平均含有量為8.37 mg/g(RSD=1.2%)。

2.7 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，在室溫下放置，分別在0、2、4、6、8、12、24 h進樣分析，測定峰面積。甘草苷、異甘草苷、甘草素、甘草酸峰面積的RSD分別為1.3%、1.6%、1.9%、1.7%。結果表明，4種化合物在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗 稱取已知含有量的復方甘草片(111012)6份(甘草苷、異甘草苷、甘草素、甘草酸的量分別為3.53、1.56、0.38、8.37 mg/g)，每份約0.25 g，精密稱定。分別準確加入甘草苷、異甘草苷、甘草素、甘草酸對照品貯備液0.80、2.00、1.00、1.20 mL。按“2.3”項下供試品溶液制備的方法操作，在上述色譜條件下進行測定，計算回收率。結果見表2～5。

表2 甘草苷加樣回收率試驗結果(n=6)

表3 異甘草苷加樣回收率試驗結果(n=6)

表4 甘草素加樣回收率試驗結果(n=6)

表5 甘草酸加樣回收率試驗結果(n=6)

2.9 樣品測定 取復方甘草片粉末3批，按“2.3”項下的方法操作，在上述色譜條件下進樣測定并計算樣品中4種成分的量，結果見表6。

表6 樣品測定結果(n=3)

3 討論

依據(jù)文獻[14-17]，本實驗分別考查了乙腈-1%冰醋酸、乙腈-0.05%磷酸、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液四個流動相系統(tǒng),結果表明采用乙腈-0.05%磷酸為流動相所得到的色譜圖4種化合物的分離效果好，干擾較小。故選用乙腈-0.05%磷酸為流動相系統(tǒng)。

提取條件分別考察了超聲、回流，結果表明，超聲30 min提取效果最好。提取溶劑分別考察了50%甲醇、70%乙醇和氨性乙醇，結果表明，氨性乙醇提取4個化合物的效果最好。

本實驗建立的 HPLC法可以同時測定復方甘草片中甘草苷、異甘草苷、甘草素、甘草酸的量，此法專屬性好，靈敏度高，操作簡便，結果準確可靠，適用于復方甘草片中甘草苷、異甘草苷、甘草素、甘草酸的質(zhì)量控制,可作為質(zhì)量控制的定量方法。

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