諾斯卡品逆轉(zhuǎn)人卵巢癌裸鼠移植瘤對(duì)順鉑耐藥的作用及機(jī)制

申薇 梁冰鋒 李秀榮 程建新 李紅方

腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)的研究對(duì)臨床化療療效的提高具有重要意義。但目前仍未發(fā)現(xiàn)高效、低毒的耐藥逆轉(zhuǎn)劑。諾斯卡品(Noscapine，NOS)是一種無毒芐基異喹啉類生物堿，一直以來作為鎮(zhèn)咳藥使用［1］。研究證實(shí)，NOS在腫瘤細(xì)胞和動(dòng)物腫瘤模型的實(shí)驗(yàn)研究中均表現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性，并且該藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞有耐藥逆轉(zhuǎn)作用，能逆轉(zhuǎn)OVCAR3細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)春新堿和多柔比星的敏感性［2，3］，但未見在卵巢癌的研究中報(bào)道。本文利用人卵巢癌SKOV3/DDP細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型，研究低劑量NOS與順鉑(cisplatin，DDP)聯(lián)合應(yīng)用對(duì)移植瘤細(xì)胞增殖、凋亡及X鏈鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor-of-apoptosis Protein，XIAP)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cysteine-aspartic acid Protease-3，Caspase-3)、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(Bell rymphoma/lewkmia-2，Bcl-2)和生存素(Survivin)表達(dá)的影響，并探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞培養(yǎng):卵巢上皮性腫瘤細(xì)胞系SKOV3/DDP由河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心提供。細(xì)胞于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，以含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液在培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)單層傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)裸鼠:BALB/c nu/nu裸小鼠購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，3～4周齡，均為雌性，體重18～22 g，合格證號(hào):SCXK(軍)2007-004。動(dòng)物飼養(yǎng)于河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，室溫控制在(25±1)℃，相對(duì)濕度為40%～60%的SPF層流罩中。室內(nèi)進(jìn)行定期紫外線照射，自由攝入無菌的標(biāo)準(zhǔn)飼料和無菌水。

1.1.3 主要試劑:NOS購自美國SIGMA公司，DDP購買自山東齊魯制藥廠，PBS緩沖液、RPMI-1640培養(yǎng)液購自美國Gibco公司，胎牛血清購自杭州四季青公，二甲基亞砜(DMSO)購自天津化學(xué)試劑。兔抗人Bcl-2和XIAP多克隆抗體購自bioworld公司，鼠抗人Survivn和Caspase-3單克隆抗體購自北京中杉金橋公司。

1.2 方法

1.2.1 藥物配制:NOS溶解于DMSO，以80 mmol/L為儲(chǔ)存濃度，保存于-80℃。不同濃度的NOS及DDP作用于含10%胎牛血清RPMIl640培養(yǎng)基培養(yǎng)的SKOV3/DDP細(xì)胞。DMSO的終濃度小于0.1%。DDP溶解于0.9%氯化鈉溶液，以2 mg/ml為儲(chǔ)存濃度，保存于4℃，按實(shí)驗(yàn)需要用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。

1.2.2 裸鼠移植瘤模型的建立、實(shí)驗(yàn)分組及藥物干預(yù)治療:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SKOV3/DDP細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為3×107/ml。將單細(xì)胞懸液注入裸鼠右肩胛部皮下，200 μl/只。接種后第2周，待右肩胛部皮下腫瘤生長(zhǎng)至直徑約5 mm，將裸鼠隨機(jī)分成4組，每組6只。對(duì)照組，腹腔注射0.9%氯化鈉溶液;NOS組，腹腔注射NOS 40 mg/kg;DDP組，腹腔注射DDP 3 mg/kg;NOS聯(lián)合DDP組，腹腔注射NOS 40 mg/kg后6 h，再腹腔注射DDP 3 mg/kg。每次注射液量均為0.2 ml，3 d給藥1次，共注射7次。結(jié)束治療后第3天脫頸處死裸鼠，摘除裸鼠移植瘤組織，秤重并測(cè)量移植瘤長(zhǎng)(a)、寬(b)，按V(cm3)=ab2/2計(jì)算腫瘤體積，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線，并計(jì)算抑瘤率。抑瘤率=(對(duì)照組平均重量 -實(shí)驗(yàn)組平均重量)/對(duì)照組平均重量 ×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)移植瘤細(xì)胞周期及凋亡率:將裸鼠移植瘤組織用70%乙醇溶液固定后，立即用網(wǎng)搓法制備單細(xì)胞懸液。取0.1 ml細(xì)胞懸液向其中加入DNA染液1 ml，在4℃冰箱中染色30 min，PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，分別應(yīng)用Muticycle AV軟件和Expo ADC軟件對(duì)細(xì)胞周期的時(shí)相分布和細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)移植瘤細(xì)胞蛋白表達(dá):取0.1 ml細(xì)胞懸液，向細(xì)胞懸液中加入XIAP、Caspase-3、Bcl-2和Survivin抗體，室溫避光放置30 min后，PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，上機(jī)檢測(cè)死亡受體XIAP、Caspase-3、Bcl-2和Survivin蛋白表達(dá)量，以平均熒光強(qiáng)度表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，3組比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩組間比較采用LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DDP和(或)NOS對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響 接種SKOV3/DDP細(xì)胞后，3 d左右皮丘消平，7 d左右裸鼠皮下瘤長(zhǎng)出，接種成功率為100%。移植瘤呈圓形或橢圓形，待瘤長(zhǎng)至5 mm時(shí)開始用藥(圖1)。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，用藥組老鼠生長(zhǎng)狀態(tài)良好，沒有出現(xiàn)體重明顯下降等現(xiàn)象，無裸鼠死亡。給藥前，各實(shí)驗(yàn)組平均腫瘤體積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);給藥結(jié)束后，聯(lián)合組裸鼠皮下移植瘤體積及重量明顯小于對(duì)照組和其他用藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。4組腫瘤生長(zhǎng)曲線見圖2，4組裸鼠體重、平均瘤體積、重量見表1。

圖1 人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤

圖2 裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)曲線

表1 4組裸鼠體質(zhì)量及移植瘤體積、體重及抑瘤率n=6，±s

表1 4組裸鼠體質(zhì)量及移植瘤體積、體重及抑瘤率n=6，±s

注:與聯(lián)合組比較，*P＜0.05

組別 移植瘤體積(mm3)7±1.88對(duì)照組2.64±0.10*2.25±0.09*-20.51±2.8223.18±2.76 NOS組2.38±0.03*2.04±0.04*9.3320.76±2.2322.96±2.62 DDP組2.04±0.03*1.73±0.16*體重(g)給藥前 停藥后聯(lián)合組1.40±0.071.19±0.1147.1120.49±2.0921.3移植瘤重量(g)抑瘤率(%)23.1120.32±1.9820.05±1.69

2.2 移植瘤細(xì)胞凋亡率 與對(duì)照組比較，NOS組細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。與DDP組和NOS組比較，聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率顯著增高(P＜0.05)。見圖3，表2。

2.3 移植瘤細(xì)胞周期分布 與對(duì)照組相比，DDP組細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例減少，S期細(xì)胞比例增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。NOS組和聯(lián)合組細(xì)胞G2/M期比例增加，與對(duì)照組和DDP組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

圖3 裸鼠移植瘤細(xì)胞凋亡率

表2 裸鼠移植瘤細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期的分布n=6，%，±s

表2 裸鼠移植瘤細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期的分布n=6，%，±s

注:與對(duì)照組比較，*P＜0.05;與NOS組比較，#P＜0.05;與DDP組比較，△P＜0.05

50±431.5±4.818.1±3.011.9±0.8 NOS組47±31.3±0.952.0±2.713.1±1.0 DDP組39±3*#49.7±4.0*#10.9±3.7*#15.0±0.5聯(lián)合組50±3△1.6±0.9＊△48.0±1.9#＊△21.0±0.7*#△細(xì)胞凋亡率對(duì)照組組別 細(xì)胞周期G0/G1期S期G2/M期

2.4 移植瘤細(xì)胞XIAP、Caspase-3、Bcl-2和Survivin蛋白表達(dá) 與對(duì)照組比較，NOS組細(xì)胞中Survivin、XIAP、Bcl-2蛋白的表達(dá)量下降，Caspase-3蛋白表達(dá)量增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但DDP組XIAP、Caspase-3、Bcl-2和Survivin蛋白表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。與DDP組比較，聯(lián)合組細(xì)胞中Survivin、XIAP、Bcl-2蛋白的表達(dá)量下降，Caspase-3蛋白表達(dá)量增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表3，圖4。

表3 裸鼠移植瘤細(xì)胞XIAP、Caspase-3、Bcl-2和Survivin蛋白的表達(dá)量n=6，±s

注:與對(duì)照組比較，*P＜0.05;與NOS組比較，#P＜0.05;與DDP組比較，△P＜0.05

組別242±6127±8293±4173±6 NOS組198±4154±12234±4142±7 DDP組239±7131±6*#286±5170±6聯(lián)合組200±5＊△161±7＊△238±4＊△141±8 XIAPCaspase-3Bcl-2Survivin對(duì)照組＊△

圖4 裸鼠移植瘤細(xì)胞XIAP蛋白表達(dá)量

3 討論

卵巢癌是目前世界范圍較常發(fā)的惡性腫瘤之一，發(fā)病及病死率高［4］。對(duì)于卵巢癌的治療，除采用手術(shù)治療外，采用DDP、紫杉醇等為主的聯(lián)合化療的輔助治療是目前治療的主要手段。但腫瘤的多藥耐藥性降低了腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，甚至造成化療的失?。?］。研究發(fā)現(xiàn)，NOS具有抗腫瘤作用，可通過抑制微管動(dòng)態(tài)不穩(wěn)定性、干擾腫瘤細(xì)胞有絲分裂的方式抑制腫瘤細(xì)胞的繁殖［6］，從而達(dá)到抗腫瘤的作用。NOS可以抑制非小細(xì)胞肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤、黑色素瘤、乳腺癌等多種癌細(xì)胞的增殖，另外對(duì)一些紫杉醇耐藥癌細(xì)胞也有較好的抑制作用。其作用機(jī)制目前還不清楚，可能包括抑制G2/M期有絲分裂及激活c-JNK、p21參與、NF-κB信號(hào)通路調(diào)節(jié)、caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)、Bcl-2/Bax下調(diào)等途徑，實(shí)現(xiàn)對(duì)癌細(xì)胞的增殖抑制，從而達(dá)到抗腫瘤的作用［7-10］，動(dòng)物試驗(yàn)表明，采用口服、注射等不同的給藥方式，對(duì)心、胸腺、十二指腸、腎、血液和骨髓等器官或組織沒有明顯的不良反應(yīng)，且與聯(lián)合藥品不產(chǎn)生交叉耐藥［11，12］。本研究將卵巢癌耐藥細(xì)胞SKOV3/DDP接種裸鼠，形成皮下移植瘤。在實(shí)驗(yàn)中裸鼠未出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)，未表現(xiàn)出進(jìn)食少、皮膚干澀、體重下降、精神萎靡等癥狀。結(jié)果表明，DDP與NOS聯(lián)合組移植瘤重量和體積明顯低于DDP組和NOS組(P＜0.05)，同時(shí)NOS改變了移植瘤細(xì)胞周期的分布，增加了DDP對(duì)移植瘤細(xì)胞的殺傷作用，提高了移植瘤細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性。提示NOS能逆轉(zhuǎn)SKOV3/DDP細(xì)胞裸鼠移植瘤對(duì)DDP的耐藥。

耐藥相關(guān)機(jī)制很多，其中耐藥蛋白的異常表達(dá)是重要因素之一。XIAP、Caspase-3、Bcl-2和Survivin蛋白是細(xì)胞凋亡途徑的重要調(diào)節(jié)因子，研究發(fā)現(xiàn)四種蛋白在食管癌、乳癌、前列腺癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)異常，并且參與了腫瘤多藥耐藥性的產(chǎn)生，在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起了至關(guān)重要的作用［13-16］。本實(shí)驗(yàn)還進(jìn)一步研究證實(shí)NOS可顯著降低Survivin、XIAP、Bcl-2蛋白表達(dá)，增高Caspase-3蛋白表達(dá)。這些結(jié)果提示NOS逆轉(zhuǎn)SKOV3/DDP細(xì)胞移植瘤耐藥作用與XIAP、Caspase-3、Bcl-2和Survivin相關(guān)。

總之，NOS增加了SKOV3/DDP細(xì)胞移植瘤細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性，逆轉(zhuǎn)其對(duì)DDP的多藥耐藥。但NOS的耐藥逆轉(zhuǎn)機(jī)制是否還有其他參與因素還有待今后的進(jìn)一步研究證實(shí)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為改善卵巢癌治療效果，尋求新的臨床治療方案提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 Ye K，Ke Y，Keshava N，et al.Opium alkaloid noscapine is an antiturnor agent that arrests metaphase and induces apoptosis in dividing cells.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95:1601-1606.

2 Ke Y，Ye K，Grossniklaus He，et al.Noscapine inhibits tumor growth with little toxicity to normal tissues or inhibition of immune responses.Cancer Immunol Immunother，2000，49:217-225.

3 Mahmoudian M，Rahimi-Moghaddam P.The anticancer activity of noscapine.Recent Patents Anti cancer Drug Discovery，2009，4:92-97.

4 Siegel R，Ward E，Brawley O，et al.The impact of eliminating socioeconomic and racial disparities on premature cancer deaths.CA Cancer J Clin，2011，61:212-236.

5 田芬，段愛紅，盧靜.復(fù)發(fā)卵巢癌的化療效果研究.河北醫(yī)藥，2009，31:448-449.

6 Zhou J，Panda D，Landen JW，et a1.Minor alteration of microtubule dynamics causes loss of tension across kinetochore pairs and activates the spindle checkpoint.J Biol Chem，2002，277:17200-17208.

7 Zhou J，Gupta K，Yao J，et al.Paclitaxel-resistant human ovarial cancer cells undergo c-Jun NH2-terminal kinase-mediated apoptosis in response to noscapine.J Biol Chem，2002，277:39777-39785.

8 Aneja R，Ghaleb AM，Zhou J，et al.P53 and p21 determine the sensitivity of noscapine-induced apoptosis in colon cancer cells.Cancer Res，2007，67:3862-3870.

9 蘇文敬，黃磊，敖啟林，等.那可丁對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞的抑制作用及機(jī)制探討.華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2011，40:287-290.

10 Mahavir Chougule，Apurva R.Patel，pratik sachdeva anticancer activity of noscapine，an opioid alkaloid in combination with cisplatin in human non-small cell lung cancer.Lung Cancer，2011，71:271-282.

11 魏少蔭，李敏.微管抑制劑那可丁及其衍生物的抗腫瘤作用研究進(jìn)展.中國新藥雜志，2006，15:1238-1242.

12 郝亞偉，陶惠民.微管抑制劑諾斯卡品抗腫瘤作用研究進(jìn)展.國際骨科學(xué)雜志，2010，37:2569-2573.

13 Lee JW，Cho MK.Phenethy is othiocyanate induced apoptosis via down regulat-ion of Bcl-2/XIAP and triggering of the mitoch ondrial pathway in MCF-7 cells.Arch Pharm Res，2008，31:1604-1612.

14 丁堅(jiān)，蔡軍.P53、XIAP與細(xì)胞凋亡的關(guān)系及其靶向的細(xì)胞凋亡在腫瘤治療中的研究進(jìn)展.實(shí)用臨床醫(yī)學(xué)，2013，14:127-130.

15 英煥春，呂靖，張淑蘭.凋亡相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)與人卵巢癌細(xì)胞順鉑耐藥的關(guān)系.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2007，17:820-824.

16 李佳平，周洪貴，唐良萏，等.Bcl2基因基因家族相關(guān)蛋白在人卵巢癌耐藥細(xì)胞凋亡中的作用.腫瘤學(xué)雜志，2008，14:118-121.