淫羊藿配合髓芯減壓術治療兔激素性股骨頭壞死的實驗研究

劉志國 馬文海 李杰

股骨頭壞死(femoral head necrosis)是由不同病因引起的股骨頭活力成分死亡的病理過程，臨床以髖關節疼痛、功能障礙為主要癥狀。該病起病隱匿，病程長，預后差，一旦發生塌陷，多發展為髖關節的退行性關節病，是骨科治療上的疑難重癥。激素性股骨頭壞死(steroid-induced femoral head necrosis)是腎上腺皮質類固醇藥物性股骨頭壞死的簡稱，為非創傷性股骨頭壞死中最為常見的類型，隨著臨床大量激素藥物的應用，其發病率呈逐年升高的趨勢。目前，手術與中醫藥治療各有利弊，探討如何將西醫手術和中醫藥的治療優勢有機結合，尋求一種療效確切，費用低廉，副作用少的綜合療法，對于提高治療激素性股骨頭壞死的療效，減輕患者和社會經濟負擔具有重要意義。本研究應用中藥淫羊藿配合髓芯減壓術治療動物激素性股骨頭壞死，觀察該療法對股骨頭骨組織再生的影響，揭示其治療激素性股骨頭壞死的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 純種健康成年雄性新西蘭大白兔60只，年齡5～6個月，體重2.5～3.5 kg，由白求恩國際和平醫院動物實驗室提供［批號:SYXK-(軍)2012-017］，屏蔽環境飼養。

1.2 主要儀器及試劑 馬血清(北京元亨圣馬生物技術研究所)，甲基強的松龍(美國輝瑞生物制藥公司)，中藥淫羊藿成品(貴州同仁堂藥業有限公司)，Trizol試劑、RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)，PCR引物(上海生工)，逆轉錄試劑盒(MBI Fermentas公司)，兔抗BMP-2多克隆抗體和兔抗IGF1多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG抗體(sigma公司，美國)，OMNI TH組織均質儀(美國OMNI公司)，PCR儀(德國Effendorf公司)，水平電泳儀(美國Bio-Rad公司)，垂直電泳儀(北京市六一儀器廠)，半干電轉儀(北京君意東方電泳設備有限公司)，柯達計算機X線攝影成像系統(900 CR)，Lunar prodigy型雙能X線骨密度儀(美國GE公司)，INSTRON 5544材料性能實驗機(美國instron公司)。

1.3 方法

1.3.1 動物模型制作及分組:將動物隨機分為對照組(n=12)和模型組(n=48)。按照Wang等［1］造模方法造模，兔耳緣靜脈注射馬血清10 ml/kg，間隔3周后，馬血清量減為6 ml/kg，經兔耳緣靜脈再次注射，間隔2周后，腹腔注射甲基強的松龍45 mg/kg，1次/d，連續3 d。注射激素期間，每只動物每次腹腔注射青霉素10萬U，1次/d，連續7 d，預防感染。經X線檢測證實造模成功后，將模型動物隨機分為模型組、手術組(髓芯減壓術)、中藥組(淫羊藿)、綜合組(隨芯減壓術+淫羊藿)，每組12只。

1.3.2 動物處理:手術組:采用髓芯減壓術治療。俯臥于手術臺上，局部備皮后消毒，沿大轉子切開皮膚皮下，分離肌肉及骨膜，在大轉子上用2 mm細鉆頭向股骨頭內鉆孔，以不越過股骨頭軟骨面為界。徹底清除髓腔后關閉切口，術后肌內注射青霉素10萬U預防感染，1次/d，共1周。中藥組:將淫羊藿加水文火煎熬至生藥質量濃度為1 g/ml，每天給予淫羊藿熬制液6 ml/kg喂養，觀察其均能在10 min內喝完，連續8周。綜合組:在做髓芯減壓術的基礎上配合喂養淫羊藿。

術后10周末，將所有動物氯胺酮復合麻醉后，備皮、消毒、固定。嚴格無菌手術下，取出雙側股骨頭，經DEPC處理的PBS液沖洗后，一側股骨頭放入液氮中凍存，用于PCR及Western blot檢測。另一側用于生物力學檢測。

1.3.3 X線檢查:于最后1次激素注射后4周末，2組各取6只動物，氯胺酮復合麻醉(安定3.5 mg/kg肌內注射15 min后，氯胺酮25 mg/kg肌內注射)后，拍雙髖正位X線片。

1.3.4 生物力學檢測:將股骨頭標本固定在材料性能實驗機的夾具內垂直加壓。平穩加載速度控制在2 mm/min，實驗儀內的計算機自動記錄位移應變等數據由Merlin軟件實驗檢測系統采集。

1.3.5 RT-PCR:采用高速均質儀進行組織粉碎處理，按Trizol試劑盒的說明要求，提取總RNA，并用DNA酶處理總RNA，瓊脂糖凝膠電泳確定RNA未降解，紫外分光光度計測定濃度。使用RT試劑盒，將RNA反轉錄為cDNA，進行PCR擴增，產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測基因的表達。目的基因檢測所用引物見表1。

表1 目的基因檢測所用引物

1.3.6 Western blot:于粉末狀骨組織中加入PIPA裂解液，提取總蛋白，BCA法測定濃度，取等量蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，隨后將蛋白電轉至PVDF膜上。膜先在5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h，加入一抗(IGF1 1∶200;BMP-2 1∶500稀釋)，4℃雜交過夜。將膜轉移到辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體中(1∶10 000稀釋)，室溫雜交1 h。將膜置于化學發光液中，曝光、顯影及定影。

1.4 統計學分析 應用SPSS 13.0統計軟件，計量資料以±s表示，行單因素方差分析(One-way ANOVA)，組間比較采用獨立性t檢驗，兩變量之間的關系采用相關分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 X線檢查結果 正常對照組股骨頭形態完整，關節面清晰，股骨頭骨密度均勻;模型組股骨頭關節面模糊，可見骨密度減低，囊性變，骨硬化等表現。見圖1。

圖1 2組注射激素后4周雙側X線表現

2.2 IGF1和BMP-2 mRNA、蛋白的表達IGF1mRNA和蛋白水平，模型組顯著高于對照組(P＜0.05)，可能是機體的自發修復反應促使其表達升高。BMP-2 mRNA和蛋白水平，模型組較對照組明顯下降(P＜0.05)。IGF1、BMP-2 mRNA和蛋白的表達，中藥組與綜合組，手術組與模型組比較差異均無統計學意義(P＞0.05);而兩者在中藥組和綜合組的表達顯著高于模型組和手術組(P＜0.05)。并且，IGF1與BMP-2 mRNA(r=0.706，P＜0.01)及蛋白(r=0.792，P＜0.01)在股骨頭的表達呈明顯正相關。見表2、3，圖2、3。

表2 股骨頭骨組織中IGF1/GAPPH和BMP-2mRNA的表達情況n=12，±s

表2 股骨頭骨組織中IGF1/GAPPH和BMP-2mRNA的表達情況n=12，±s

注:與對照組比較，*P＜0.01;與模型組比較，#P＜0.01;與手術組比較，△P＜0.01

組別BMP-2/GADPHmRNAIGF1/GADPHmRNA模型組0.769±0.093*1.029±0.082*1.491±0.0820.563±0.067手術組0.876±1.107*1.057±0.093*中藥組1.164±0.104*#△1.301±0.087*#△綜合組1.157±0.096*#△1.387±0.095*#△對照組

表3 股骨頭骨組織中PFGH和BMP-2蛋白的表達情況n=12，±s

表3 股骨頭骨組織中PFGH和BMP-2蛋白的表達情況n=12，±s

注:與對照組比較，*P＜0.01;與模型組比較，#P＜0.01;與手術組比較，△P＜0.01

組別IGF1/GADPH蛋白BMP-2/GADPH 蛋白模型組0.551±0.091*0.437±0.082*0.419±0.0830.959±0.093手術組0.578±0.089*0.453±0.078*中藥組0.845±0.103*#△0.705±0.103*#△綜合組0.907±0.107*#△0.737±0.099*#△對照組

圖2 RT-PCR檢測股骨頭組織中IGF1和BMP-2mRNA的表達

圖3 Western blot檢測股骨頭骨組織中IGF1和BMP-2蛋白的表達

2.3 骨密度 與對照組比較，模型組骨密度明顯下降(P＜0.01)。中藥組、手術組、綜合組均較模型組有所改善(P＜0.05或＜0.01)，其中綜合組改善效果明顯好于中藥組和手術組(P＜0.05)。見表4。

表4 5組股骨頭骨密度的改變n=12，g/cm2，±s

表4 5組股骨頭骨密度的改變n=12，g/cm2，±s

注:與對照組比較，*P＜0.05，#P＜0.01;與模型組比較，△P＜0.05，☆P＜0.01;與綜合組比較，▲P＜0.05

組別 骨密度值綜合組0.265±0.021＊☆0.276±0.027中藥組0.229±0.025#△▲手術組0.215±0.029#△▲模型組0.161±0.023#對照組

2.4 生物力學測定結果 與對照組比較，模型組骨結構力學參數抗壓強度、剛度均明顯下降(P＜0.05或＜0.01);中藥組、手術組、綜合組均較模型組有不同程度改善(P＜0.05或＜0.01)，其中綜合組改善效果明顯好于中藥組和手術組(P＜0.05)。見表5。

表5 5組生物力學參數測定n=12，±s

表5 5組生物力學參數測定n=12，±s

注:與對照組比較，*P＜0.05，#P＜0.01;與模型組比較，△P＜0.05，☆P＜0.01;與綜合組比較，▲P＜0.05

組別 抗壓強度(N)剛度(N/mm)綜合組922±109＊△839±66＊☆964±117882±64中藥組860±122＊△▲741±72#△▲手術組836±133＊△▲726±58#△▲模型組778±128*672±50#對照組

3 討論

激素性股骨頭壞死占非創傷性股骨頭壞死的首位，并有逐年增高的趨勢。建立股骨頭壞死的動物模型對探索成功的治療模式是必不可少的。用馬血清致動物出現Ⅲ型變態反應，即抗原抗體復合物沉積在血管壁上引起超敏性血管炎，此后應用糖皮質激素可抑制膠原和彈性纖維的合成，進而導致小動脈斷裂或栓塞，髓內出血，最終導致股骨頭壞死。同時，激素誘導骨髓脂肪化，脂肪細胞增生肥大，成骨細胞減少，髓內壓升高，血管受壓，脂肪損害血管內皮細胞，局部血栓形成，或脂肪栓塞進一步導致骨壞死的發生。本實驗參照Wang等［1］的方法，用改進的馬血清加甲基強的松龍的方法誘導制備兔激素性股骨頭壞死動物模型，其影像學改變符合臨床典型的股骨頭壞死的特征，且具有簡便、動物死亡率低、成功率高等優點。

近年研究者發現胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)是骨基質中的重要生長因子之一，其作為一種自分泌調節因子而影響骨骼形成和成骨細胞的功能，它們可由骨骼細胞分泌，具有調節骨保護素，抑制破骨細胞的分化成熟，減少骨吸收，系統調節促進骨形成和骨吸收的偶聯，加速骨轉化的作用。IGF1還可刺激骨骼Ⅰ型膠原蛋白合成及加快骨基質的沉積速度，降低骨膠原蛋白的分解和抑制膠原蛋白酶的合成，有效促進骨細胞的有絲分裂和成骨細胞的功能分化，增強堿性磷酸酶活性和鈣鹽沉著［2］。同時，IGF1對軟骨細胞形態發生和有絲分裂以及功能代謝都有廣泛影響［3］。骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)是目前應用最多的一類促骨生長因子。其中BMP-2是公認的最主要的骨形成調控因子，其誘導成骨的生物學作用和長期效果也已被證實。近年研究發現，BMP-2的表達受多種因子的調節，如王霖霞等［4，5］以不同濃度的IGF1刺激分離培養的大鼠成骨細胞，發現IGF1可在轉錄水平增加大鼠成骨細胞中BMP-2基因的表達，并呈明顯的劑量依賴關系，我們通過檢測兔激素性股骨頭壞死治療前后IGF1、BMP2 mRNA及蛋白的表達，發現兩者表達呈明顯正相關，由此推測在骨修復過程中，IGF1對BMP2的表達可能具有正向調節的作用。

髓芯減壓術(core decompression)作為治療股骨頭缺血性壞死的一種方法已有三十余年的歷史。其通過降低骨內高壓，排出壞死組織，刺激加壓孔周圍的血管形成，增強壞死骨的爬行替代，使壞死灶得以消除。但研究認為，Ⅰ期患者經過隨芯減壓治療后，臨床效果好，Ⅱ期治療應慎重，Ⅲ期治療效果不好［6］。髓芯減壓術只能緩解疼痛的癥狀，一旦發生股骨頭壞死，它的病理過程將持續發展，最終全髖置換術將不可避免。我們研究發現，髓芯減壓術后，IGF1和BMP-2的表達沒有發生改變。可見，單純髓芯減壓術并不能緩解激素對壞死骨組織自我修復的抑制作用，因此仍有一定的局限性，若能結合其他促進股骨頭隧道內血管再生及骨形成的治療，必將加快股骨頭的修復，提高療效并擴大適應證。中藥淫羊藿具有溫腎壯陽、強筋骨、祛風濕的功能，廣泛應用于腎虛所致的腰膝酸軟、筋骨衰弱失用等，其主要化學成分為黃酮類化合物、木脂素及生物堿，其中淫羊藿總黃酮主要參與骨代謝，具有促進體外成骨細胞增殖及分化成熟，抑制破骨細胞的活性，從而達到治療骨質疏松的作用。王欣文等［7］通過X線攝片、骨密度測定、生物力學測試以及組織學切片證實，淫羊藿促進家兔骨折愈合效果明顯，與BMP-2的效果相當。在治療激素性股骨頭壞死方面，研究發現，淫羊藿可以降低血液流變學的各項指標、保證組織有效灌注、改善股骨頭的局部微循環［8］;降低血液內三酰甘油和總膽固醇的水平，有效改善股骨頭內環境，促進損傷修復［9］;有效抑制皮質激素對OPG/RANKL/RANK系統的影響，使OPG/RANKL比值接近正常，阻止由于OPG/RANKL表達異常導致的破骨細胞異常活化［10］。我們研究發現，中藥組與模型組，綜合組與手術組相比，IGF1和BMP-2表達明顯升高，骨密度及抗壓力均有所增加，提示淫羊藿通過上調IGF1和BMP-2的表達而加快激素性股骨頭壞死的修復。

綜上，我們可知隨芯減壓術可以緩解疼痛，延緩骨壞死的進展，但不能很好地促進壞死骨組織的自我修復，而中藥淫羊藿可促進骨生長，加快修復。淫羊藿配合隨芯減壓術可以利弊互補，有效增加股骨頭骨密度，提高骨強度，阻止股骨頭變形，為臨床上治療激素性股骨頭壞死提供了一種較為有效的方法。

1 Wang Wei，Wang Kunzheng，Liu Liying，et al.The dynamic expression of PPARγ and BMP2 in the setroid-induced osteonecrosis of femoral.Chinese Journal of Orthopaedics，2008，28:327-332.

2 浮煜，賀西京，王宇強，等.仙仲注射液對兔早期膝關節炎形態學及胰島素樣生長因子-1的影響.中國中西醫結合雜志，2007，27:237-240.

3 Abdallah BM.Osteoblast differentiation of NIH3T3 fibroblasts is associated with changes in the IGF-I/IGFBP expression pattern.Cell Mol Biol Lett，2006，11:461-474.

4 王霖霞，李玉坤.BMP-2信號通路與成骨細胞分化.國際骨科學，2009，30:132-136.

5 梁冬春，王寶利，左愛軍，等.胰島素樣生長因子1對成骨細胞中BMP2、BMP7基因表達的影響.中國骨質疏松雜志，2004，10:45-47.

6 Aigner N，Schneider W，Eberl V，et al.Core decompression in early stages of femoral head osteonecrosis-an MRI controlled study.Int Orthop，2002，26:31-35.

7 王欣文，何愛詠，蔡羽中，等.淫羊藿及骨形態發生蛋白2與家兔的骨折愈合.中國組織工程研究與臨床康復，2011，15:2030-2033.

8 李慧英，王義生.淫羊藿對激素性股骨頭壞死大鼠血液流變學及骨密度的影響.中華實驗外科雜志，2012，29:1226-1228.

9 李慧英，孟東方.淫羊藿提取液對激素性股骨頭壞死的作用.中國組織工程研究與臨床康復，2010，50:9395-9398.

10 王建忠，高鴻雁，王坤正，等.淫羊藿對激素性股骨頭壞死骨組織OPG/RANKL mRNA表達的影響.南方醫科大學學報，2011，31:1714-1717.