骨髓間充質干細胞移植對急性心肌梗死中血管內皮功能及心功能的影響

張凌云

急性心肌梗死是心血管疾病中較常見的病種，近年來其發病率和病死率居高不下并趨于年輕化，心肌梗死后心肌細胞的丟失和心室重構是導致心力衰竭和臨床死亡的主要原因。目前治療措施主要有:藥物治療、冠狀動脈介入、冠狀動脈旁路術等這些治療只能使梗死血管恢復再灌注，并不能恢復已經壞死心肌功能，研究證明，心肌梗死區周圍的心肌細胞雖可以發生分裂，但修復梗死心肌的能力有限。因此，細胞水平心肌成形術逐漸得到推廣:即用細胞移植的手段增加心肌細胞的數量，修復壞死的心肌，從而改善心功能，降低病死率，為心肌梗死的治療提供了新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集我院2010年9月至2012年1月收治40例急性心肌梗死的患者的臨床資料，所有病例均符合急性心肌梗死的診斷標準為:(1)心電圖相鄰兩個胸前臂導聯ST段抬高≥0.2 mV，或至少兩個肢體導聯ST段抬高≥1 mm或相鄰導聯出現Q波，或新出現的左束支傳導阻滯;(2)冠狀動脈造影術:至少有一個冠狀動脈主支或大分支完全閉塞;(3)缺血性胸痛持續時間≥30 min含服硝酸甘油無緩解;(4)實驗室檢查:心肌酶肌酸激酶(CK)或其同工酶(CKMB)＞正常2倍以上，肌鈣蛋白I(TNI)升高(至少具備以上兩個條件)。排除標準:(1)既往肺部疾病，結締組織病、腫瘤;(2)心肌梗死發病超過24 h入院者;(3)心肌梗死前1周內用過他汀或抗炎藥者;(4)腎臟疾病、心功能不全病史及血液系統疾病;(5)炎性疾病、風濕免疫性疾病;(6)有外傷或6個月內經歷過任何外科手術。其中男32例，女8例;年齡42～78歲，平均年齡(56±4)歲;治療時間2～21 h，平均(8.9±2.2)h。吸煙者25例，其中合并高血壓病22例，高血脂20例，糖尿病15例。所有患者均簽署知情同意書，愿意參加本研究。將該40例心肌梗死的患者按照是否采用干細胞移植分為骨髓間充質干細胞移植組(移植組)和急診經皮冠狀動脈介入術(PCI)組及正常組，每組20例，同時選取我院進行健康體檢者20例作為正常組，其中男15例，女5例;年齡42～78歲，平均年齡(56±4)歲。3組患者在年齡比、性別、病程、既往史、合并癥等一般資料方面具有可比性(P＞0.05)。

1.2 方法

1.2.1 常規治療:移植組與PCI組均給予常規藥物治療，給予阿司匹林100 mg/d、辛伐他汀(40 mg/d)或阿托伐他汀(20 mg/d)，每日晚口服1次;噻氯吡啶(50 mg/d)，餐時口服;低分子肝素鈉5 000 U每12小時1次，臍周皮下注射。同時采用血管緊張素轉化酶抑制劑(ACEI)、硝酸酯類藥物、β受體阻滯劑、鈣離子拮抗劑等藥物治療。

1.2.2 干細胞移植:①干細胞的采集和分離:在患者冠狀動脈造影術前4 h，于髂后上棘對患者進行局部麻醉，在無菌條件下多點穿刺抽取骨髓液100～120 ml加肝素6 000 U抗凝，然后移至營養液的血漿袋內，0℃保存，按照密度梯度離心法進行分離，將所得液體按1∶4比例6%羥乙基淀粉加入靜置30 min，將沉降的紅細胞棄去，留取上清夜在放入低溫的低速離心機中以800 r/min進行離心10 min，將離心后液體棄上清夜按照1∶1加入淋巴分離液，然后以2 000 r/min離心20 min，留取分離后的骨髓單個核細胞分離液12～15 ml，然后進行培養、接代，［細胞達到1×(106～107)/ml進行培養4～5 d細胞量達到90%融合時進行傳代，傳至3代BMMNC按1×107/ml移至無菌營養袋］置于4℃下進行保存，備用。取樣進行細胞計數、微生物檢查，檢測到細胞總數為(1.4±0.4)×109個，所有細胞懸液均未見有細菌生長，流式細胞儀進行、CD133細胞含量分析，檢測到定細胞為(1.78±0.21)×105個。CD133為(0.44±0.15)×105之后轉移至導管室置于4℃備移植使用。②骨髓間充質干細胞的注入:采用經導管冠狀動脈內注入，冠狀動脈造影后，將指引導管置于左冠狀動脈開口處，在0.014 F導絲指引下，將over-the-wire球囊(將直徑1.5～2.0 mm，長度10 m)置于前降支支架遠端，抽出導絲給6 atm將球囊充盈阻斷前降支血流，通過導管的中心腔分4～5次緩慢將骨髓單個核細胞懸液1×107/ml注入靶血管遠端，每次推注時間2 min，反復共3次。期間觀察患者的癥狀、血壓、心電圖和冠狀動脈血流等變化。細胞移植時間均在血管再通后7～14 d進行。

1.2.3 血漿標本的采集:分別于急診PCI術前或細胞移植術前、干細胞移植術后24 h、移植術后1、3、6個月時抽取靜脈血4 ml，PCI組于相應時間點采血，4 h內處理標本。常溫3 000 r/min離心10 min，留取上層血清置于-80℃冰箱保存待測。

1.2.4 指標的檢測:測移植組、PCI組和正常組的可溶性細胞間黏附分子(SICAM-1)、可溶性血管內皮細胞黏附分子(SVCAM-1)、SE-選擇素(SE-selection)這些指標的測定采用酶聯免疫吸附法實驗方法操作，并觀察移植組和PCI組治療前后的心功能變化。

1.2.5 心功能檢測

1.2.5.1 射血分數(EF):彩色多普勒超聲儀器為索諾聲MICROMAXX，S4經胸探頭，融合頻率2～4 MHz，檢查時患者取左側臥位，沿胸骨左緣聲窗探查，以雙平面Simpson法測量LVEF值，檢測時由專人操作，所有數據均重復測量3次，取其平均值。

1.2.5.2 6min步行試驗:實驗參照Vera Bittner報道的方法進行，試驗場所為30 m的直走長廊，兩端各置一椅作為標志。避免外界干擾，患者在其間往返走動，步履緩急由患者根據自己的體能決定，囑患者盡最大可能行走，在6 min內走完其其走完的最遠的距離。每2分鐘由在旁監測的人員報時1次，并記錄患者可能發生的氣促、胸痛等不適。如患者體力難支可暫時休息或中止試驗。運動試驗前及運動后，記錄心率、血壓及呼吸頻率，監測生命體征，所有數據均重復測量3次，取其平均值。

1.3 統計學分析 應用SPSS 17.0統計軟件，計量資料以±s表示;多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組SICAM-1，SVCAM-1和SE-selection水平比較(1)移植組術前與PCI組術前SICAM-1、SVCAM-1、SE-selection含量差異無統計學意義(P＞0.05)，均顯著高于正常組(P＜0.05);(2)移植組與PCI組術后24 h，SICAM-1、SVCAM-1、SE-selection含量差異無統計學意義(P＞0.05)，但略低于其術前，高于正常組(P＜0.05);(3)1個月、3個月后移植組與PCI組SICAM-1、SVCAM-1、SE-selection的含量差異無統計學意義(P＞0.05)，且2組均顯著低于術前，高于正常組(P＜0.05);(4)6個月后，移植組SICAM-1、SVCAM-1、SE-selection含量顯著低于PCI組(P＜0.05)，且2組均顯著低于術前(P＜0.05)，且均高于正常組(P＜0.05)。見表1～3。

表1 3組SICAM-1水平比較n=20，ng/ml，±s

表1 3組SICAM-1水平比較n=20，ng/ml，±s

注:與正常組比較，*P＜0.05;與PCI組比較，#P＜0.05

移植組術前139±13743±26*742.45±21.43組別 正常組PIC組*術后24 h-654±34*639.67±45.51*術后1個月 -532±32*443.43±31.76*#術后3個月 -432±12*327.56±9.12*#術后6個月 -320±9*165.11±7.21*#

表2 3組SVCAM-1水平比較n=20，ng/ml，±s

表2 3組SVCAM-1水平比較n=20，ng/ml，±s

注:與正常組比較，*P＜0.05;與PCI組比較，#P＜0.05

移植組術前339±15677±18*669.12±27.45組別 正常組PIC組*術后24 h-643±14*636.38±15.75*術后1個月 -533±18*428.92±11.34*#術后3個月 -456±20*323.45±11.08*術后6個月 -369±13*244.45±12.45*#

表3 3組SE-selection水平比較n=20，ng/ml，±s

表3 3組SE-selection水平比較n=20，ng/ml，±s

注:與正常組比較，*P＜0.05;與PCI組比較，#P＜0.05

移植組術前13±472.1±5.3*72.0±6.12組別 正常組PIC組*術后24 h-66.3±3.1*65.3±2.32*術后1個月 -56.4±3.6*42.3±5.78*#術后3個月 -44.9±8.3*31.0±3.53*#術后6個月 -26.3±4.3*20.8±1.12*#

2.2 3組EF和6 min行走試驗比較EF和6 min行走試驗1個月和3個月后，移植組與PCI組差異無統計學意義(P＞0.05)，且2組均顯著低于正常組(P＜0.05);6個月后，移植組顯著高于PCI組(P＜0.05)，且均低于正常組(P＜0.05)。見表4、5。

表4 3組EF水平比較n=20，%，±s

表4 3組EF水平比較n=20，%，±s

注:與正常組比較，*P＜0.05;與PCI組比較，#P＜0.05

移植組術前62±935±6*34±7組別 正常組PIC組*術后1個月 -36±8*36±10*術后3個月 -40±7*42±9*術后6個月 -43±6*50±7*#

表5 移植組與PCI組6 min試驗比較n=20，m，±s

表5 移植組與PCI組6 min試驗比較n=20，m，±s

注:與正常組比較，*P＜0.05;與PCI組比較，#P＜0.05

移植組術前432±16222±42*219±40組別 正常組PIC組*術后1個月 -306±54*309±56*術后3個月 -336±51*342±54*術后6個月 -357±33*391±50*#

3 討論

心梗后心力衰竭是心血管疾病致死的常見病因，其病變主要是因為冠狀動脈血供急劇減少或是中斷引起的，冠狀動脈嚴重閉塞以后導致了急性缺血發生，缺血嚴重后心肌梗死細胞有少量組織分裂增生發生，發生分裂增生的細胞數量不大，所以這些修復細胞并不能完整的修復心肌組織［1，2］。目前認為對心肌梗死患者最有效的治療是保護和增加具有收縮功能的心肌細胞。因此研究認為需要尋找一種新的方法來治療心肌梗死，目前認為干細胞可以自體繁殖，而且對于身體器官里的各種器官都可以起到新的修復作用，對于心肌梗死的病情有很大的幫助，隨著對干細胞研究的深入，將干細胞植入受損心肌組織中分化為心肌細胞，以替代壞死心肌改善心功能為心肌梗死的治療提供了一種新思路［3，4］，受到了廣泛關注。

3.1 骨髓間充質干細胞移植對內皮功能的影響 血管內皮細胞可以產生和分泌血管內皮細胞VCAM-1、ICAM-1、E-selection等幾十種生物活性物。這些生物活性物質能夠調節細胞之間，細胞與細胞基質之間相互結合，起到的黏附作用能夠令細胞表面參與介導，在動脈粥樣硬化形成過程中，細胞黏附在血管內皮中，并且向著血管內皮下行移動，然后慢慢的衍化成為巨噬細胞，攝取脂質，這些內皮細胞上的黏附分子即ICAM-1、VCAM-1、E-selection，他們均屬于細胞黏附分子中免疫球蛋白超家族，參與不同細胞間的識別和黏附。本實驗檢測三種內皮細胞黏附因子在干細胞移植術后的降低說明干細胞移植可通過下調黏附分子的表達，保護內皮細胞的功能，防止病情進展。

3.2 骨髓間充質干細胞移植對心功能的影響(1)移植的MSCs對于心室擴張和重建有著很大的治療價值，其作用機制是通過肌纖維的彈性來限制心室擴張，這樣就能夠有效避免了心肌細胞的繼續受損，而且能夠對于疤痕區有一定的增厚性，這樣就可以堆心肌收縮性有所改善;(2)EF值是反映左心室收縮功能的指標，6 min步行試驗是評價心功能的次級量運動試驗，本研究通過檢測患者的在干細胞移植術后的射血分數變化，并通過6 min步行試驗發現，雖然移植組的患者在住院期間及術后3個月的EF和6 min步行試驗距離與單純PCI組的患者差異無統計學意義(P＞0.05)。但移植組術后6個月患者的射血分數和6 min步行試驗距離顯著優于對照組(P＜0.05)。這說明干細胞移植顯著改善了患者的心功能。

本研究時間較短，未進行長期跟蹤隨訪，無法觀察到患者有無并發癥及不良反應的發生。由于多種原因，本研究的樣本量不大。干細胞移植為心肌梗死的治療提供了一種新思路。

1 Weiss RA，The Leeuwenhoek Lecture 2001.Animal origins of human infectious disease.Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci，2001，356:957-958.

2 Hung LM，Chen JK，Huang SS，et al.Cardio protective effect of resveratrol，a natural antioxidant derived from grapes.Cardiovascular Res，2010，47:549-555.

3 Stamm C，Westphal B，Kleine HD，et al.Autologous bone-marrow stem cell transplantation for myocardial regeneration.Lancet，2003，361:45-46.

4 Badorff C，Brandes RP，Popp R，et al.Transdifferentiation of functionally active cardiomyocytes.Circulation，2003，107:1024-1032.