施用不同生物有機肥對連作黃瓜枯萎病防治效果及其機理初探

袁玉娟， 胡 江， 凌 寧， 仇美華， 沈其榮， 楊興明*

(1 南京農業大學江蘇省固體廢棄物資源化高技術研究重點實驗室, 江蘇南京 210095； 2 南通農業職業技術學院，江蘇南通 226007)

利用優質的有機肥作為介質，加入功能型拮抗菌進行二次固體發酵，研發一種新型的生物有機肥(bio-organic fertilizer, BIO)。通過足量的有機物質提供生防菌以足夠的營養與能源物質，幫助生防菌在土壤中定殖和繁殖，充分發揮生防菌促進作物生長和拮抗某些土傳病原微生物等作用。本試驗通過施用菌株SQR9和T37二次固體發酵獲得的生物有機肥，采用營養缽育苗方法檢驗BIO控制連作障礙地黃瓜枯萎病及促進黃瓜生長的能力，并對二菌株在黃瓜根際的定殖情況進行觀察，初步揭示了這兩株拮抗菌的生防機理。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 試驗中所用的拮抗菌和病原菌均為本實驗室篩選，其中拮抗真菌為哈茨木霉屬(Trichodermaharzianum) T37、 拮抗細菌為枯草芽孢桿菌屬(Bacillussubtilis)SQR9以及菌株SQR9的GFP標記菌株SQR9-G。病原菌為尖孢鐮刀菌黃瓜?；?FOC)。

1.1.3 黃瓜品種 “津春4號”(天津黃瓜研究所)。

1.1.4 供試土壤和肥料 營養缽育苗土壤為未種植過黃瓜的健康水稻土；大盆土壤為黃瓜枯萎病發病土壤(采自江蘇徐州銅山縣)。供試微生物有機肥(本實驗室自行研制)為氨基酸有機肥料和豬糞按1 ∶1比例混合發酵而成。氨基酸有機肥料含有機質44.2%、 氨基酸8.0%、 N 4.4%、 P2O52.3%、 K2O 0.67%和水分28.5%；豬糞堆肥含有機質30.4%、 N 2.01%、 P2O53.7%、 K2O 1.1%和水分28.5%。

1.2 盆栽試驗

1.2.2 黃瓜種子準備 黃瓜種子用0.02%的氯化汞消毒5分鐘，無菌水沖洗三次，放置在無菌的紗布中30℃催芽。

盆栽試驗處理： 1) CK (CK營養缽+CK盆缽)；2) OF (OF營養缽+OF盆缽)；3) BIOⅠ(BIOⅠ營養缽+ BIOⅠ盆缽)；4) BIOⅡ (BIOⅡ營養缽+ BIOⅡ盆缽)；5) BIOⅢ(BIOⅢ營養缽+ BIOⅢ盆缽)。

1.2.4 統計方法 黃瓜移苗后，早晚觀察記錄植株生長狀況。每隔20 d取樣，分別取根際土和土體土進行分析。每天記錄發病的植株數量，在試驗結束時計算累積發病率。發病率(%)=發病株數/(發病株數+健康株數)×100[8]

1.2.5 計算黃瓜根際土中FOC的數量 在試驗結束前，采用real-time PCR的方法檢測根際土中病原菌FOC的數量。每個處理隨機抽取5個盆缽，采集黃瓜根際土樣。將黃瓜的根輕輕地剝離出來，抖動植株的根，大的土壤顆粒被抖落，將粘結比較緊密的土壤從植物的根上剝落收集起來作為黃瓜的根際土。熒光定量PCR 擴增反應體系[9]為25μL，SYBR? Premix ExTaqTM(2×) (TakaRa) 混合液13 μL，上下游引物各0. 5 μL，DNA 模板2 μL，雙蒸水9 μL。熒光定量PCR 擴增條件[9]： 95℃ 2 min，94℃ 15 s，58℃ 15 s，72℃10 s，40個循環。

1.3 生防菌SQR9和T37的根表定殖能力測定

1.3.1 菌液制備 SQR9-G菌液制備： 取-70℃保存的SQR9菌液在LB固體加卡納霉素的抗性平板上活化，取單菌落接種于3 mL LB加卡納霉素的液體培養基中，37℃過夜培養。再以1%的接種量轉接于100 mL LB加卡納霉素的液體培養基中，37℃、 170 r/min震蕩培養24 h。細菌終濃度為7.3×109cfu/mL。

T37菌液制備： 接種木霉菌株T37于PDA斜面培養基，25℃培養，進行菌種活化。取培養好的木霉菌斜面，加入適量無菌水，刮下分生孢子打散，倒入滅菌的三角瓶中，制成1×107個cfu/mL浮液，作為接種物。按0.5%的比例接種至裝有50 mL種子培養基的250 mL三角瓶中，25℃、 130 r/min震蕩培養6 d。然后將成熟種子接種至裝有100 mL發酵培養基的500 mL三角瓶中，25℃、 180 r/min震蕩培養10 d。孢子終濃度為8.2×108cfu/mL。

1.3.2 定殖試驗[7]SQR9-G定殖試驗： 無菌條件下，在無機培養基中加入0.5 mL菌液，將催芽后的黃瓜種子置于培養基中，15 d后收集黃瓜植株根系制片，分別在熒光顯微鏡和電鏡下進行觀察。

T37定殖試驗： 采用蛭石，加入10 mL菌液，再將催芽后的黃瓜種子置于蛭石中，定時定量澆水，然后15 d取黃瓜植株根系制片，在電鏡下進行觀察。

2 結果與分析

2.1 不同處理對黃瓜枯萎病發病率的影響

在黃瓜移植后62 d，各處理的發病率見圖1。CK發病率達到100%，施用沒有拮抗菌強化的有機肥處理(OF)發病率為88.2%，單獨采用菌株SQR9強化的處理BIOⅠ發病率達到51.0%，而單獨采用哈茨木霉T37強化的處理BIOⅡ和兩個菌株一起強化的處理BIOⅢ，可以將發病率控制在19.6%和13.7%。該結果表明，哈茨木霉T37較枯草芽孢桿菌SQR9能更好地防治黃瓜枯萎病，尤其是施用兩個功能菌一起強化的生物有機肥效果更顯著。

2.2 不同處理對黃瓜干重的影響

不同有機肥處理對黃瓜的生物量的影響如圖2所示，與CK和OF相比，處理BIOⅠ、 BIOⅡ和BIOⅢ的黃瓜干重有顯著的提高；處理OF、 BIOⅠ、 BIOⅡ和BIOⅢ的黃瓜干重分別比CK增加了52%、 155%、 146%和158%。BIOⅠ、 BIOⅡ和BIOⅢ表現出了良好的促生能力，SQR9單獨強化的BIOⅠ略高于T37單獨強化的BIOⅡ，而經SQR9和T37共同強化的BIOⅢ并沒有顯示出比BIOⅠ或BIOⅡ顯著的促生效果。

圖1 不同處理對黃瓜發病率的影響Fig.1 Effect of different treatments on the Fusarium wilt incidence of the cucumber plants[注(Note)： 柱上不同字母表示差異顯著(P<0.05)Different letters above the bar mean significant differences at the 0.05 level.]

圖2 不同處理對黃瓜干重的影響Fig.2 Effect of different treatments on the dry weight of the cucumber plants[注(Note)： 柱上不同字母表示差異顯著(P<0.05)Different letters above the bar mean significant differences at the 0.05 level.]

2.3 不同處理對植株高度的影響

從植株的生長高度來看，不同處理也存在顯著差異(圖3)。處理OF、 BIOⅠ、 BIOⅡ和BIOⅢ的地上部株高分別為CK的1.44、 2.20、 2.18和2.53倍；處理BIOⅠ和BIOⅢ的地下部高度較CK分別增加了0.55和1.20倍，而CK、 OF和BIOⅡ間差異不顯著。結果表明，施用BIOⅠ和BIOⅢ能顯著促進植株生長。

2.4 不同處理對尖孢鐮刀菌數量的影響

尖孢鐮刀菌黃瓜專化型是黃瓜枯萎病的致病菌，土壤中尖孢鐮刀菌的數量直接影響到枯萎病的發病情況。由表1可以看出連作土壤中病原菌達到×107copies/g，土，施用普通有機肥能使病原菌的數量降低一個數量級左右，約為×106copies/g，土，施用BIOⅠ土壤中病原菌為×105copies/g，土；而BIOⅡ和BIOⅢ處理能顯著降低土壤中病原菌的數量，均降低到×103copies/g，土。

表1 不同處理對黃瓜根際尖孢鐮刀菌數量的影響Table 1 Effect of different treatment on numbers of Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum in cucumber rhizosphere

注(Note): 數值后小寫字母表示處理間達5%顯著水平 Values followed by small letters mean significant differences atP<0. 05.

2.5 菌株SQR9根際定殖

為了更好地了解枯草芽孢桿菌SQR9在黃瓜根系的行為，我們采用GFP標記的SQR9-G，研究了該菌株在黃瓜根際的定殖情況。培養15 d后，圖4-A為熒光顯微鏡拍攝的圖片，由圖片可清晰地觀察到黃瓜根表附著大量的SQR9-G，并在根表形成大量菌斑；圖4-B為電鏡拍攝的圖片，同樣能夠反映該菌體在黃瓜根系有效定殖，在根表形成生物膜。拮抗菌在植物根系的定殖是其實現預定的生防效果的保證，而SQR9在黃瓜根系良好的定殖情況，是解釋其促進植物生長、 抑制病原菌數量的機理之一。

2.6 生防木霉T37根際定殖

培養15 d后，由圖5-A掃描電子顯微鏡拍攝的圖片，可以清晰地看到T37的菌絲附著在黃瓜根表，并產生了大量的附著胞子。冷凍處理后可以更清晰地觀察到T37纏繞在黃瓜根表(圖5-B)。

3 討論

枯草芽抱桿菌通過成功定殖至植物根際、 體表或體內，與病原菌競爭植物周圍的營養，分泌抗菌物質以抑制病原菌生長，同時誘導植物防御系統抵御病原菌入侵，從而達到生防的目的[10]。木霉菌對植物病原真菌的拮抗作用包含多種機制,一般認為有競爭作用、 重寄生作用及抗生作用[11]。國內外很多研究同時證明，枯草芽孢桿菌[12-14]和木霉[15-17]不僅能防治土傳病害，而且還能作為促生菌來促進作物生長。本研究中使用了本實驗室篩選的兩株高效拮抗菌株(枯草芽孢桿菌SQR9和哈茨木霉T37)，比較了單一菌株和復合菌株復合有機肥制成的幾種不同生物有機肥防治土傳黃瓜枯萎病的效果，結果發現施用經單一菌株(SQR9或T37)或混合菌株制成的生物有機肥料都能夠有效地控制連作障礙地黃瓜枯萎病，其中復合菌株制成的生物有機肥(BIOⅢ)能將發病率控制在13.7%(圖1)。從生物量看(圖2)，施用BIO處理的植株，生物量顯著高于CK和OF處理，相對于CK處理，BIOⅢ處理提高了1.5倍。這說明SQR9和T37對黃瓜的生長都有一定的促進作用。另外，從植株高度看，施用BIO處理的植株，無論是地上部還是地下部，都顯著高于CK和OF處理。結果證明，SQR9和T37都能夠有效促進黃瓜生長。較BIOⅡ處理，BIOⅠ和BIOⅢ處理無論是地上部還是地下部的植株高度都有相對的提高，其原因可能是枯草芽孢桿菌SQR9相對于木霉T37更能夠促進黃瓜作物的生長。

單一的菌株制劑[18-21]或者純有機肥產品[22-25]對連作土壤中枯萎病的防治效果都很有限。本研究采用拮抗菌菌株與優質氨基酸有機肥二次固體發酵制成的新型生物有機肥，集成了拮抗菌和有機肥的優點，不僅抑制病原菌生長，減少枯萎病的發生，同時提供充足的養分，促進作物生長。產品幾乎對環境沒有副作用，基本符合農業可持續發展的要求。試驗中所用有機肥不僅提供充足養分供植物生長需要，而且提供足夠養分供拮抗菌生長，從而提高拮抗菌的競爭能力。吳洪生等[26]研究表明芽孢桿菌和有機肥復合后制成的生物有機肥能抑制西瓜枯萎病；張慧等[27]研究指出，施用拮抗棉花黃萎病的生物有機肥使棉花黃萎病的病情指數顯著降低；Saravanan T等[28]報道在土壤中使用熒光假單胞桿菌和蘋果渣混合物能很好地抑制香蕉枯萎??；張樹生等[29]用枯草芽孢桿菌SQR5和多粘芽孢桿菌SQR21混合強化的有機肥料能有效防治黃瓜枯萎病。這與本研究得出的各種生物有機肥與傳統的有機肥相比，對土傳黃瓜枯萎病的防治效果更為明顯(圖1)的結果相一致。因此，利用多株拮抗菌復合有機肥制成的生物有機肥能夠有效提高生防菌株的防治效果，并且這將成為生物防治土傳病害的重要趨勢之一，然而不同生防菌之間是如何協同作用的，還有待進一步的研究。

引入植物根部的生防菌最終能否發揮防病促生的效果，很大程度上取決于該菌在不斷伸展的植物根圍的定殖能力，定殖能力強弱決定著生防的成功與失敗[30]。本研究中也通過熒光顯微鏡和電鏡觀察發現生防菌SQR9和T37能在黃瓜根系表面大量的定殖。結果還發現SQR9還能在根表形成生物膜，這與前人報道的多粘芽孢桿菌在植物根際定殖方式相似[31]。本研究中還采用了營養缽育苗施用BIO的方式，我們認為這種施用方式更適合生防制劑的生態行為[7]，它能較好地發揮根際施肥的優勢，使有益拮抗微生物在黃瓜苗期就定殖于植株根際。施用的BIO中含有足量的有機物質供給功能微生物以足夠的能源物質，使這些功能微生物易于在土壤中定殖，形成優勢群落[32]。功能微生物一旦成為優勢群落，就能分泌足夠量的具有特定生物活性的次生代謝物質(植物激素、 抗生素等)，在植物根系表面形成有效的“生物防御層”[31]，抑制病原菌的生長，保護黃瓜根系免受病原菌的侵入，從而降低了黃瓜枯萎病的發病率。

由于能在黃瓜植株根表形成“生物防御層”，移入盆缽土壤后黃瓜根系定能有效抵御尖孢鐮刀菌病原菌的侵入，并能顯著降低根表尖孢鐮刀菌的數量。我們通過real-time PCR方法對黃瓜根際病原菌計數(表1)后發現： 在黃瓜根際，BIOⅠ處理、 BIOⅡ處理和BIOⅢ處理的FOC數量顯著低于CK處理，說明BIO提供的拮抗菌能夠占領病原菌的生態位，抑制了FOC的生長[31]。經過BIOⅢ處理后，FOC數量可以下降到103水平。BIOⅡ處理和BIOⅢ處理的病原菌數量沒有顯著的差異，病原菌數量都低于BIOⅠ，這種結果可能是由于哈茨木霉T37有更好的定殖能力。對比發病率和病原菌數量的結果，可以發現發病率高的處理根際病原菌的數量也高，反之亦然。發病率的高低取決于根際土壤的尖孢鐮刀菌數量[33]。

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