雌激素對中華鱉性腺分化及DMRT1、SOX9基因表達的影響

王 莉胡 濤宓猛冬楊克周錢國英葛楚天

(1. 浙江萬里學院生物與環境學院, 寧波 315100; 2. 上海海洋大學水產與生命學院, 上海 201306)

雌激素對中華鱉性腺分化及DMRT1、SOX9基因表達的影響

王 莉1,2胡 濤1宓猛冬1楊克周1錢國英1,2葛楚天1

(1. 浙江萬里學院生物與環境學院, 寧波 315100; 2. 上海海洋大學水產與生命學院, 上海 201306)

中華鱉(Pelodiscus sinensis)性別決定的方式一直存在較大的爭議, 分子機制更是不清楚。在大部分脊椎動物中, 雌激素在性別決定和性腺分化中扮演重要的調控作用。實驗通過對性別分化前胚胎進行雌二醇(E2)和芳香化酶抑制劑(AI)處理, 研究雌激素在中華鱉性腺分化中的作用及機理。實驗結果顯示, 與對照組(雌性比例49%)相比, E2處理組中雌性中華鱉仔鱉比例顯著增加, 高達92.3%; 而在AI處理組中, 雌性比例顯著下調至13.1%。HE染色分析表明, ZZ(雄性)和ZW(雌性)胚胎分別經過E2和AI處理后, ZZ和ZW性腺結構呈現明顯的雌性化和雄性化特征。同時, 通過RT-PCR和免疫熒光染色發現, E2能顯著降低雄性性別關鍵因子DMRT1和SOX9 mRNA和蛋白表達水平; AI則表現相反的調節作用。綜上所述, 雌激素通過抑制雄性性別關鍵因子DMRT1和SOX9的表達來抑制雄性分化, 促進雌性分化, 揭示雌激素在中華鱉雌性性別分化中起著重要的調控作用。

雌激素; DMRT1; SOX9; 性別分化; 性腺發育; 中華鱉

中華鱉(Pelodiscus sinensis)的性別決定方式一直存在較大爭議[1—4], 現已基本確定中華鱉存在微小性染色體 ZW, 屬于基因型性別決定機制(Genetic sex determination, GSD)[5], 但目前中華鱉性別決定和性腺分化的分子機理尚不清楚。性別決定是一個復雜的、多基因精確調控和激素介導的過程。哺乳動物GSD的分子機理研究表明位于Y染色體的SRY基因是性別決定的主控基因, 上調SOX9、SF1、MIS、WT1和DAX1等基因的表達, 聯合性激素的介導作用, 最后決定性器官的分化發育[6,7]。因此, 要解析中華鱉性腺分化的分子機理首先是要找出其性別決定的關鍵基因及其與性激素之間的互作關系。

在參與性別決定和性腺分化的關鍵基因中, DMRT1(Double sex-and mab3-related transcription factor1)基因是目前為止已知的唯一在動物門間保守的基因。在脊椎動物中, DMRT1與SRY基因相似,在雄性胚胎中專一性表達, 并參與了雄性的性別決定過程, 該基因的缺失會導致性反轉現象。相關研究表明在鳥類、一些魚類和兩棲類上, DMRT1或其同源基因位于雄性性染色體(Z或Y)上, 是性別決定的主控基因[8—10]。在龜鱉類中, DMRT1基因在雄性性腺中呈現特異性表達, 如紅耳龜[11]和太平洋麗龜[12]。SOX9(Sry-type HMG box9)基因是另一個重要的雄性性腺分化關鍵基因, 在哺乳動物雄性睪丸發育中與SRY基因共同作用調控下游基因的表達[13]。在八孔海龜中, SOX9基因在雄性性腺中的表達量顯著高于雌性性腺[14]。本實驗室已克隆獲得了中華鱉DMRT1和SOX9基因, 并發現它們在中華鱉性腺發育中呈現雄性特異性表達。

除了關鍵基因外, 性激素往往在性腺分化過程中也扮演著重要的調控角色。在龜鱉類性腺分化發育過程中, 精巢來自雙向潛能性腺髓質的發育和皮質的退化; 卵巢剛好相反, 來自雙向潛能性腺皮質的發育和髓質的退化[15]。雌激素在該過程中起重要作用:它對雙向潛能性腺的皮質和髓質的發育分別起促進和抑制作用, 從而決定性腺的雌性發育方向[16,17]。研究發現, 在產雄性溫度下, 向菱斑龜、密河鱷、恒河鱷胚卵注入雌二醇, 可誘導胚胎向雌性方向發育[18,19]。動物體內的內源雌激素是由內源雄激素轉化而來, 芳香化酶(P450arom)是催化該反應的關鍵酶, 可使雄烯二酮或睪酮氧化脫去19-甲基, 轉變成雌酮或雌二醇, 控制著體內雌雄性激素的平衡[20]。雌性歐洲龜經過芳香化酶抑制劑處理后, 體內雌激素合成受到抑制, 性腺向雄性方向發育[21]。

本實驗采用雌二醇與芳香化酶抑制劑在特定的發育時間點上對中華鱉胚胎進行處理, 待仔鱉出殼后對鱉胚性腺結構進行組織學分析, 同時從 mRNA和蛋白水平分析DMRT1和SOX9基因的表達變化,研究雌激素在中華鱉性腺分化中的作用及對DMRT1和SOX9基因表達的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

雌二醇(17β-estradiol, E2), 芳香化酶抑制劑來曲唑購自大連美侖生物科技有限公司; PCR擴增、反轉錄試劑盒購自 TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司; 驢血清購自杭州聯科生物技術有限公司; 鼠源β-Catenin單克隆抗體、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚購自美國Sigma公司; DMRT1、SOX9兔源多克隆抗體購自美國Millipore公司; Alexa Fluor?488 驢抗兔IgG(H+L)、Alexa Fluor?594 驢抗鼠IgG(H+L)購自美國Invitrogen公司。

1.2 中華鱉卵孵化及性激素處理

中華鱉卵采自浙江紹興中亞鱉養殖場, 采用全裸無接觸式加濕孵化箱進行孵化。中華鱉受精卵采集時間控制在產卵后 12h之內, 將采集的鱉卵直接裸立于孵化盤定位孔中, 設定孵化溫度 31 , ℃ 開啟超聲波霧化加濕器, 濕度控制在 75%—85%。孵化1d后, 棄去未受精卵, 調整動物極, 使其朝上發育。設置3個孵化箱, 分別為對照組、雌激素處理組和芳香化酶抑制劑處理組, 每組為200枚中華鱉受精卵。

孵化至15期時, 在正對胚胎的卵殼上滴加5 μL藥物。對照組為 5 μL 95%乙醇, 實驗組分別為50 μg/μL雌二醇(E2)和 50 μg/μL芳香化酶抑制劑(AI)。孵化至第17期進行第二次藥物處理(用量與第一次等同)。

1.3 性腺提取及處理

收集出殼的稚鱉, 統計孵化率和平均體重, 宰殺后在體視顯微鏡下分離并提取性腺-中腎復合體。剝離一條性腺用于 RNA提取, 另一半性腺-中腎復合體用于組織學染色分析; 同時取每只稚鱉的心臟組織用于染色體核型分析。

1.4 性腺總RNA提取及RT-PCR

將每組中10個性腺組織, 按Trizol試劑說明書進行總RNA提取, 用核酸蛋白分析儀(Nanodrop)測定總 RNA濃度及純度, 用 RNase-free水稀釋使總RNA 濃度約為 2—5 μg/μL, –80℃冷凍保存。在PrimeScript Reverse Transcriptase (TaKaRa)和1 μL Oligo d(T)18Primers引物作用下合成 cDNA。以此cDNA為模板, 按照以下參數表 1進行 PCR擴增: 94 ℃ 預變性5min; 94℃變性 30s, 退火30s, β-actin引物退火溫度為 59.5 , ℃ DMRT1基因引物退火溫度為57.3 , ℃ SOX9基因引物退火溫度為56.6 , 72℃ ℃延伸 1min, 循環35次; 然后72℃再延伸10min; 4℃保存。PCR擴增產物使用凝膠成像分析系統拍照。

表1 引物序列Tab. 1 Primer sequences

1.5 石蠟切片

將取出的另一半組織保存于 4%多聚甲醛內,室溫固定24h后轉入50%乙醇。在體視顯微鏡下進行組織形狀修正, 經過乙醇濃度由低到高梯度脫水,二甲苯透明, 純石蠟包埋, 進行常規石蠟連續切片,以(5—6) μm厚度為宜。

1.6 蘇木精-伊紅染色

將切片進行二甲苯脫蠟, 乙醇梯度水分滲透,蘇木素-伊紅染色, 脫水, 封片。正置顯微鏡(OLYMPUS)下觀察拍照。

1.7 免疫熒光染色

脫蠟后切片放入 0.01 mol/L檸檬酸鈉溶液, 95℃抗原修復 20min, 冷卻至室溫。在封閉液(10%正常驢血清, 3%BSA, 0.1%Triton X-100, 0.01 mol/L PBS)中室溫孵育 1h, 吸去周邊多余液體, 分別加兔抗SOX9(1∶500)、DMRT1(1∶250)和鼠抗β-catenin (1∶250), 4℃過夜。用0.01 mol/L PBST和洗脫液(1%Normal Donkey Serum, 3%BSA, 0.1%Triton X-100, 0.01 mol/L PBS)清洗10 min×3; 在室溫避光環境下, 滴加羊抗兔IgG 488(1∶250)和羊抗鼠IgG 594(1∶250), 孵育1h, 用0.01 mol/L PBST和洗脫液清洗10min×4。滴加DAPI(286 nmol/L)液室溫避光染色5min, 0.01 mol/L PBS清洗5min×3。加抗熒光淬滅液封片, 于熒光正置顯微鏡拍照。

2 結果

2.1 雌二醇(E2)及芳香化酶抑制劑(AI)處理后的性腺組織形態學觀察

正常25期雄性(ZZ)性腺外形呈橢圓形, 皮質區退化為單細胞層, 髓質區發育, 原始性索形成, 并由大量的 Sertoli前體細胞圍繞原始生殖細胞組成(圖1A)。25期雌性(ZW)性腺外形呈傘狀, 皮質區發育, 髓質逐漸退化, 大量生殖細胞分布在皮質區(圖1C)。ZZ性腺經過E2處理后, 外形大致呈現傘狀, 比正常雌性稍大, 皮質區明顯發育, 4—5層生殖細胞位于其中, 髓質區明顯退化, 中間形成腔隙結構,此時的性腺具有明顯的雌性性腺特征(圖1B)。ZW性腺經過AI處理后, 性腺結構明顯雄性化, 皮質區趨于退化, 髓質區發育, 形成較明顯的原始性索,原始生殖細胞主要分布于髓質區(圖1D)。

2.2 E2和AI對中華鱉胚胎雌雄比例的影響

中華鱉鱉胚經過藥物處理后, 孵化出殼, 對性腺進行H&E染色分析其生理性別比例。從表2可以看出, 鱉卵經過藥物處理后, 孵化率沒有受到影響,仔鱉生長正常。在對照組中, 雌雄比約為 1∶1, 雌性占出殼總數的 49.0%。E2處理組中, 雌性性別比例顯著增加, 高達92.3%。而在AI處理組中, 由于雌激素受到抑制, 雌性比例顯著下調至13.1%。該數據表明, 雌激素在中華鱉性腺分化中具有重要的調控作用。

2.3 E2和AI對DMRT1和SOX9基因mRNA表達的影響

為了確認雌激素在中華鱉性腺分化中的作用, 本文還研究了E2和AI對性腺分化關鍵基因DMRT1和SOX9表達的影響。首先檢測了這兩個基因的mRNA表達水平。如圖2所示: DMRT1和SOX9基因在正常雄性中高度特異性表達, 在正常雌性中均不表達。經過E2處理后, 雄性(ZZ)胚胎性腺中SOX9基因表達量下調, DMRT1基因表達甚至消失。而雌性(ZW)胚胎經過AI處理后, SOX9和DMRT1基因開始出現表達, 但表達量均低于正常雄性。RT-PCR實驗結果表明, 在中華鱉性腺分化過程中, 雌激素能抑制雄性性腺分化關鍵基因DMRT1和SOX9的表達。

圖1 E2及AI處理后中華鱉性腺組織形態學觀察Fig. 1 Histological analysis of E2or AI-treated embryonic gonads in Pelodiscus sinensis

表2 E2及AI對中華鱉胚胎雌雄比例的影響Tab. 2 The effect of E2or AI on sex ratio of embryos in Pelodiscus sinensis

圖2 E2和AI對中華鱉SOX9和 DMRT1基因mRNA表達水平的影響Fig. 2 Effects of E2or AI on the mRNA expressions of SOX9 and DMRT1 genes during gonadal differentiation in Pelodiscus sinensis

2.4 E2和AI對DMRT1和SOX9蛋白表達的影響

為了進一步驗證雌激素能抑制 DMRT1和SOX9的表達, 本實驗通過免疫熒光染色, 檢測性腺中DMRT1和SOX9蛋白在E2或AI處理后的表達情況。

中華鱉DMRT1蛋白在雄性性腺髓質中大量表達, 主要定位于性索中Sertoli前體細胞的細胞核中,并圍繞著原始生殖細胞(圖3A-D); 但在正常雌性性腺中未見表達(圖3I-L)。β-連鎖蛋白(Catenin)作為細胞黏附的重要調控因子, 與細胞膜上 cadherin蛋白結合, 參與細胞的黏附作用。在中華鱉性腺中, β-catenin蛋白主要位于雄性性腺髓質區性索細胞以及雌性性腺皮質區細胞的細胞膜上(圖3B、J)。雄性胚胎經過 E2處理后, DMRT1蛋白表達消失, β-catenin蛋白在皮質區細胞中大量表達, 呈現典型的雌性性腺結構(圖3E-H)。雌性胚胎經過AI處理后, DMRT1蛋白開始在性腺髓質區表達; 除了皮質區, β-catenin蛋白在髓質區也有少量表達, 呈現雌雄同體現象(圖3M-P)。

如圖4所示, 在正常雄性中華鱉胚胎性腺中, SOX9蛋白主要在Sertoli前體細胞的細胞核中大量表達, 充滿整個性腺髓質區(圖4A-D); 雌性性腺中并未檢測到SOX9熒光信號(圖4I-L)。經過E2處理后, 雄性性腺中 SOX9蛋白表達顯著下調, 并且主要定位于皮質區生殖細胞的周圍細胞中, β-catenin蛋白主要分布于皮質區細胞中(圖4E-H)。雌性胚胎經過AI處理后, SOX9蛋白表達顯著增加, 在髓質區和皮質區中均有分布; β-catenin蛋白亦在髓質區和皮質區中表達(圖4M-P)。

圖3 E2和AI處理后中華鱉性腺的DMRT1&β-catenin免疫熒光染色Fig. 3 DMRT1 & β-catenin immunofluorescence of E2or AI-treated gonads in Pelodiscus sinensis

圖4 E2和AI處理后中華鱉性腺的SOX9&β-catenin免疫熒光染色Fig. 4 SOX9 & β-catenin immunofluorescence of E2or AI-treated gonads in Pelodiscus sinensis

以上免疫熒光染色結果與 RT-PCR分析結果相一致, 表明雌激素的確能抑制DMRT1和SOX9的表達, 促進性腺向雌性方向分化。

3 討論

在除哺乳動物外的大部分脊椎動物中, 雌激素在早期性腺分化中發揮重要的調控作用, 主要表現在: 在雄性性腺分化期間施加外源性雌激素能拮抗遺傳因子或環境信號, 誘導雄性向雌性的性別逆轉[22—24]; 而在雌性動物性別決定前注射芳香化酶抑制劑能誘導雌性向雄性的性別逆轉[25—28]。本實驗采用雌二醇(E2)與芳香化酶抑制劑(AI)在中華鱉性腺分化早期對胚胎進行處理后發現, E2處理組中雌性子代比例高達 92.3%, 性腺皮質區發育, 髓質區明顯退化, 向雌性性腺轉化; 而AI處理組中的雄性比例可達86.9%, 性腺結構明顯雄性化。本研究表明雌激素信號在中華鱉雌性性別分化中起重要的調控作用。Wibbels, et al. 和Crews, et al.研究發現, 雌激素和芳香化酶抑制劑均能誘導蜥蜴和巴西龜胚胎發生性別逆轉[25,26]。Olmstead, et al.亦發現外源性芳香化酶抑制劑可誘導非洲爪蟾雌性性腺發育為雄性性狀[27]。這說明, 在爬行動物中, 雌激素在早期性別分化中的調控作用極可能是高度保守的。

雌激素對中華鱉雄性胚胎的雌性誘導作用雖然已經確定, 但是關于其如何誘導雙向潛能性腺向雌性方向發育的分子機制還不清楚。在性別決定和性腺分化的關鍵基因中, DMRT1和SOX9基因是非常保守的雄性決定因子。DMRT1基因沉默的ZZ遺傳雄雞中出現了雌性化的卵巢組織[8], SOX9基因在小鼠胚胎性腺向睪丸分化中是必需和有效的, 其與雄性分化的相關性在脊椎動物中呈現高度保守[29—31]。在巴西龜中, 向胚胎注射雌二醇能顯著抑制DMRT1和SOX9基因的表達[32]。另外, Durando, et al.發現雄性寬吻鱷胚胎進行雌二醇處理后, SOX9表達顯著下降[33], 提示雌激素參與雄性性別決定因子的表達調控。我們前期研究發現, DMRT1和SOX9基因在中華鱉性腺發育過程中呈高度雄性特異性表達。在本實驗中, 我們對中華鱉雄性和雌性胚胎分別進行雌二醇(E2)和芳香化酶抑制劑(AI)處理, 結果顯示在E2組中DMRT1和SOX9 mRNA和蛋白表達顯著下降, AI組中DMRT1和SOX9表達則急劇上升。這說明雌激素通過抑制DMRT1和SOX9的表達來抑制雄性分化, 從而誘導雌性發育, 與Barske和Capel的研究結果相一致[34]。此外, Murdock 和Wibbels研究發現 DMRT1在紅耳龜雄性性腺中的特異性表達早于 SOX9[35]。我們在前期研究中, 亦發現中華鱉DMRT1基因先于SOX9在雄性性腺中開始表達, 加上本實驗中雌激素對DMRT1的抑制作用較SOX9基因明顯, 推測出龜鱉類動物的 DMRT1基因可能作用于SOX9的上游。

綜上所述, 本實驗發現雌激素通過抑制雄性性別關鍵因子DMRT1和SOX9的表達來抑制雄性分化,從而促進雌性分化和卵巢發育, 揭示了雌激素在中華鱉雌性性別分化中的重要調控作用, 而關于中華鱉性別決定的具體分子機理尚待進一步研究。

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THE EFFECTS OF ESTROGEN ON GONADAL DIFFERENTIATION AND EXPRESSIONS OF DMRT1 AND SOX9 IN PELODISCUS SINENSIS

WANG Li1,2, HU Tao1, MI Meng-Dong1,YANG Ke-Zhou1, QIAN Guo-Ying1,2and GE Chu-Tian1
(1. College of Biological and Environmental Sciences, Zhejiang Wanli University, Ningbo 315100, China; 2. College of Fisheries and Life Sciences, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

The molecular mechanism of sex determination in Pelodiscus sinensis has been a long-standing mystery. In many vertebrate species, estrogens play a key role in sex determination and gonadal differentiation. To investigate the effect of estrogens in the gonadal differentiation of P. sinensis and the underlying molecular mechanism, we treated the undifferentiated embryos with 17β-estradiol (E2) and aromatase inhibitor (AI). Results showed that the female ratio increased by 92.3% after E2treatment, whereas female ratio in AI treatment group decreased dramatically to 13.1%. Meanwhile, the obvious masculinization of genetically female embryos and feminization of genetically male embryos were observed after AI and E2treatment, respectively. Moreover, RT-PCR and immunofluorescence analysis showed that E2could significantly downregulated mRNA and protein expressions of DMRT1 and SOX9, which were the key factors involving in male development. However, AI exerted the opposite effect. In conclusion, estrogens inhibited the male development via the inhibition of expression of DMRT1 and SOX9, and consequently led to female development, indicating the important role of estrogens in the female sexual differentiation in Pelodiscus sinensis.

Estrogens; DMRT1; SOX9; Sexual differentiation; Gonadal development; Pelodiscus sinensis

Q344+.1

A

1000-3207(2014)03-0467-07

10.7541/2014.66

2013-08-29;

2013-12-25

國家自然科學基金(31101884); 973計劃前期專項(2011CB111513); 浙江省公益性技術應用研究項目(2013C32054);寧波市科技創新團隊(2012B82016); 寧波市自然科學基(2012A610142)資助

王莉(1987—), 女, 山西呂梁人; 碩士研究生; 主要從事龜鱉類性別決定研究。E-mail: wlerdans@gmail.com

葛楚天(1983—), 男, 浙江寧海人; 博士, 副教授, 碩士生導師; 主要研究為動物生殖生物學。E-mail: cge@zwu.edu.cn