三種不同IL-15基因轉染對NCI-H446腫瘤細胞凋亡的影響

李雪平 董文輝 王智華 張征崢

細胞凋亡在腫瘤的發生、發展和轉歸中起重要作用，促進腫瘤細胞凋亡，是治療腫瘤的手段之一。許多基因參與腫瘤凋亡。在以往研究中，我們發現不同IL-15基因轉染可明顯降低人小細胞肺癌細胞株NCIH446腫瘤細胞的增殖速率，但降低的程度彼此不盡一致［1］。IL-15基因轉染是否也與腫瘤細胞凋亡有關，本文就其對NCI-H446細胞的凋亡及凋亡相關蛋白Fas表達做進一步研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 野生型人小細胞肺癌細胞株NCIH446腫瘤細胞(Cw)，三種轉染不同形式IL-15基因的NCI-H446細胞模型(轉染原型IL-15基因的CIL-15、轉染IL-15成熟肽基因的CIL-15mp和轉染以IL-2信號肽替代IL-15信號肽的改型IL-15基因的CIL-2sp-IL-15mp)由河北醫科大學免疫室提供［2］;G418、DMEM、和PI(碘化丙啶)為美國Sigma公司產品;FITC標記Fas抗體為美國BD公司生產，流式細胞儀為美國貝克曼公司Epics XL型。

1.2 細胞凋亡檢測 分別取對數生長期的Cw、CIL-15、CIL-15mp和 CIL-2sp-IL-15mp細胞，2.5 g/L 胰蛋白酶消化后，預冷的PBS洗2次。分別取1×106個細胞，70%(V/V)酒精固定。上機前加入100 mg/L PI染液(含 500 mg/L Rnase)0.5 ml，閉光染色30 min，流式細胞儀檢測，CXP軟件分析結果。實驗重復3次。

1.3 Fas蛋白檢測 分別取對數生長期的Cw、CIL-15、CIL-15mp和 CIL-2sp-IL-15mp細胞，2.5 g/L 胰蛋白酶消化后，預冷的PBS洗2次。分別取1×106個細胞，每個樣本加入FITC標記的抗人Fas抗體20 μl，避光15 min，離心2次，洗去未結合抗體，500 μl PBS重懸細胞，流式細胞儀檢測，CXP軟件分析結果。實驗重復3次。

1.4 統計學分析 應用SPSS 13.0統計軟件，分別進行多個樣本均數間兩兩比較的方差分析和相關性分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞凋亡率 四種細胞調亡率分別為:Cw(3.63±1.25)%、CIL-15(12.53 ± 2.18)%、CIL-15mp(17.97 ± 2.39)% 和 CIL-2sp-IL-15mp(29.30 ±4.19)%，4組間差異均有統計學意義(P＜0.05或＜0.01)。見圖 1。

圖1 細胞凋亡率

2.2 Fas蛋白表達 四種細胞Fas蛋白表達率分別為:Cw(19.87 ±3.23)%、CIL-15(29.90 ± 4.02)%、CIL-15mp(44.33 ±6.03)%和 CIL-2sp-IL-15mp(56.77±6.36)%，4組間差異均有統計學意義(P＜0.05或＜0.01)。見圖2。

圖2 Fas蛋白表達率

3 討論

將有抗瘤作用的細胞因子基因轉染腫瘤細胞，是腫瘤基因治療的重要途徑之一。研究表明IL-15具有抗腫瘤作用，且其抗瘤作用似于并且優于IL-2。用腺病毒載體將IL-15基因轉染進鼠肺癌細胞株LLC(LLC/IL-15)中，接種到同基因鼠的肺組織中發現，腫瘤組織周圍有大量的NK細胞浸潤，說明LLC/IL-15細胞在同基因鼠體內激發了NK細胞的殺瘤活性［3］。由于IL-15mRNA的長信號肽影響IL-15蛋白的分泌，影響其抗瘤效果，有研究將改型的促分泌IL-15基因轉染colon26腫瘤細胞，可以誘導CD8陽性細胞介導的腫瘤特異性免疫［4］。

許多基因轉染可影響腫瘤細胞的凋亡，但有關IL-15基因轉染對腫瘤細胞凋亡影響少有報道。我們將3種不同IL-15基因轉染非小細胞肺癌腫瘤細胞株NCIH446，目的是觀察原型、成熟肽及改型(IL-2信號肽替換IL-15信號肽)3種不同IL-15基因的抗瘤作用。

Fas屬于TNF受體家族，Fas與FasL結合激發相關細胞的死亡信號，引發DNA斷裂，致使細胞發生凋亡［5］;HAHNE等對黑色素瘤細胞研究發現，Fas表達與腫瘤的凋亡呈負相關，FasL表達與腫瘤的進展呈正相關［6］;一些細胞因子可以誘導不表達或低表達Fas抗原的腫瘤細胞表達或增量表達Fas蛋白［7］。

本研究結果顯示，3種IL-15基因轉染都可使NCI-H446腫瘤細胞凋亡率增加，但程度不同，細胞調亡率由高到低依次為 CIL-2sp-IL-15mp、CIL-15mp、CIL-15，表明不同IL-15基因轉染可以促進NCI-H446腫瘤細胞凋亡，強度由強到弱依次為改型基因、成熟肽基因、原形基因，細胞凋亡率增加與3種不同IL-15基因轉染致NCI-H446腫瘤細胞Fas蛋白表達水平的增加相一致。提示不同IL-15基因通過促進Fas表達，激發Fas與FasL結合，誘導NCI-H446腫瘤細胞凋亡。

1 王智華，王潤田，丁軍穎，等.不同IL-15基因轉染對NCI-H446腫瘤細胞增殖的影響.免疫學雜志，2006，22:639-641.

2 張征崢，王潤田，王 麗，等.三種不同IL-15基因轉染NCI-H446細胞模型的建立與鑒定.免疫學雜志，2005，21:331-333.

3 Yoshimuta T.Gene therapy for murine Lung cancer using an adenoviral vector expressing Interleukin-15.Kurume Med J，2004，51:225-233.

4 Araki A，Hazama S，Yoshimura K，et al.Tumor Secreting high levels of IL-15 induces specific immunity to low immunogenic colon adenocarcinoma via CD8+T cells.Int J Mol Med，2004，14:571-576.

5 Kumar D，Zimpelmann J，Robertson S，et al.Tubular and interstitial cell apoptosis in the strep tozotoc in 2 diabetic rat kidney.Nephron Exp Nephrol，2004，96:77-88.

6 Hahne M，Rimoldi D，Schroter M，et al.Melanoma cell expression of Fas(Apo-1/CD95)ligand:implications for tumor immune escape.Science，1996，274:1363-1366.

7 Owen-Schaub LB，Radinsky R，Kruzel E，et al.Anti-Fas on nonhematopoietic tumors:levels of Fas/APO-1 and bcl-2 are not predictive of biological responsiveness.Cancer Res，1994，54:1580-1586.