紅平菇漆酶基因異源表達及對染料脫色的研究

鄭苗苗， 邵淑麗， 張東向， 張令昂， 焦戰戰

(齊齊哈爾大學 生命科學與農林學院， 黑龍江 齊齊哈爾 161006)

漆酶(laccase)是一種含銅的多酚氧化酶，屬于藍色多銅氧化酶家族[1]。漆酶通過催化O2將4個電子還原生成水，底物作用范圍廣泛，在很多方面有較大的應用價值[2-3]。最早由日本吉田在漆樹的分泌物中發現漆酶，隨后又在一些真菌中發現漆酶。近些年來，漆酶一直是醫學、生物學、化學和環境科學等領域中十分活躍的研究熱點[3]。迄今為止，漆酶廣泛存在于植物、真菌、細菌、昆蟲中[2]。其中真菌中白腐菌是最重要的漆酶生產菌，但是該菌漆酶產量低、熱穩定性差、生長周期較長，而且漆酶的分泌還需要酚類化合物作為誘導，不利于大規模工廠化生產[4-5]。近年來，漆酶相關研究在國際上越來越受到重視，漆酶不僅具有降解木質素特性，還能降解多種復雜化合物，所以漆酶在印染工業、紡織工業、造紙工業及其他領域有相當大的研究價值及應用潛力，因此，探索廉價、安全的漆酶生產方法策略吸引了國內外學者的興趣。國內外學者已在對漆酶異源表達的研究方面有了許多報道。多個漆酶基因已實現了異源表達，宿主有釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)[6]、甲醇畢赤酵母(Pichia methanolica)[7]和構巢曲霉(Aspergillusnidulans)[8]等。

染料的降解已成為污水處理的首要問題[9]。各種染料在化學結構上差異較大，而且污染后的水對生物具有毒性。由于復雜的化學結構，許多染料很難降解。以往化學和物理方法處理廢水效果較差，而且成本高。白腐真菌漆酶在處理廢水中染料具有相當大的優勢。目前為止，白腐真菌降解染料是最有效的途徑[10]，因此，通過異源表達獲得的重組漆酶對染料脫色效率的研究，以及在污水處理中的應用有著非常重要的研究價值。

紅平菇是一種味道鮮，具蟹味，既可作美味佳肴，又可作盆景觀賞的食用菌，也是一種白腐真菌。到目前為止，已經對紅平菇的栽培技術、多糖的結構和純化、抗腫瘤方面和保健功能以及相關基因等有了較深入的研究[11]。本文中所用的紅平菇菌株購自福建三明真菌研究所，菌株生長條件適合于北方地區栽培。由于紅平菇既具有食用價值，又具有分解各種合成染料的潛在能力，因此，研究其相關基因和異源表達具有十分重要意義。本文研究了紅平菇漆酶Pd-lac1基因在酵母中完成異源表達、酵母重組菌株分泌漆酶變化曲線和對不同復雜合成染料的脫色率，報道了從紅平菇中克隆的漆酶基因在畢赤酵母中實現了異源表達和分泌表達的產酶變化曲線，及重組漆酶對染料脫色的研究，為今后漆酶在治理環境方面的應用奠定了一定的基礎。

1 實驗部分

1.1 材 料

菌株：紅平菇菌株Pleurotusdjamor，由齊齊哈爾大學生物技術學科微生物實驗室提供。PichiapastorisSMD1168H(菌株號)購自Invitrogen公司；E.coliTop10感受態細胞，E.coliJM109感受態細胞，購自大連寶生物公司。

質粒：表達載體pPICZB購自Invitrogen公司；克隆載體pMD18-T simple veetor購自大連寶生物公司。

YPD/Zeocin平板培養基：15 g/L蛋白胨；15 g/L瓊脂粉；15 g/L酵母粉；15 g/L葡萄糖； 100 μg/mL Zeocin。

Low Salt LB液體培養基：10 g/L酵母粉；5 g/L胰蛋白胨；10 g/L NaCl。

Low Salt LB/Zeocin平板培養基：5 g/L酵母粉；15 g/L瓊脂粉；10 g/L胰蛋白胨；5 g/L NaCl； 25 μg/mL Zeocin。

BMMY液體培養基：20 g/L蛋白胨；4×10-5%生物素；10 g/L酵母粉；50 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH值為6.5)； 1.34% YNB；1%甲醇。

BMGY液體培養基：20 g/L蛋白胨；4×10-5%生物素；10 g/L酵母粉；50 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH值為6.6)； 1.34% YNB； 1%甘油。

試劑：Zeocin、XbaI、BglⅡ、EcoRI限制性內切酶(NEB)、T4 DNA連接酶(NEB)購自Invitrogen公司；DNAquick_真菌基因組DNA提取系統(TIANDZ)、E.Z.N.A真菌RNA提取試劑(TIANGEN)、兩步法RT-PCR試劑盒、TaKaRa Genome Walking Kit試劑盒、質粒DNA小提試劑盒(TIANGEN)、高保真Taq酶、DL 15,000 DNA Marker(TaKaRa)、Tryptone、Yeast Extract(Oxoid)、生物素D-biotin(sigma)；山梨醇D-sorbitol(Difco)；溶壁酶Lyticase(Tiangen)；YNB(Difcol)、DMP(2,6-Dimethoxyphenol)、ABTS[2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic)]，購自大連寶生物公司。

1.2 紅平菇總RNA的提取

采用文獻[12]中優化后的漆酶培養基培養紅平菇。用OMEGA試劑盒提取紅平菇總RNA，產物用核酸檢測儀測定純度，通過瓊脂糖凝膠電泳檢驗完整性。

1.3 紅平菇漆酶Pd-lac1完整CDS序列克隆

1.3.1試驗酶切引物的設計

擴增漆酶CDS序列引物如表1所示。

表1 擴增漆酶CDS序列引物Tab.1 Primers for amplifying laccase CDS

1.3.2漆酶完整CDS序列的PCR擴增

使用二步法RT-PCR試劑盒進行RT-PCR擴增，以總RNA為模板進行RT-PCR的反轉錄cDNA第一鏈擴增，用酶切引物進行PCR擴增，獲得漆酶CDS序列。反應體系為50 μL，含5×Prime STARTM Buffer(Mg2+plus)9 μL，dNTP Mixture(10 mM)5 μL，Prime STARTM HS DNA Polymerase(2.5 U/μL)0.5 μL，引物Pdlac1-RT1和Pdlac1-RT2各1 μL，反轉錄cDNA 5 μL。反應條件: 95 ℃預變性5 min，95 ℃ 40 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 5 min，35個循環，72 ℃ 8 min。PCR產物經凝膠電泳檢測，檢測結果用TaKaRa Genome Walking Kit試劑盒純化，與pMD18-T simple veetor連接，轉化到E.coliJM109中，在含有IPTG、X-Gal、Amp的LB瓊脂培養基上進行培養，形成單菌落。挑取白色單菌落放入含有Amp抗性的液體LB培養基中，25 ℃、180 r/min振蕩培養約8 h，提質粒進行PCR鑒定。

1.4 紅平菇漆酶Pd-lac1重組質粒的構建

首先用EcoRI、XbaI限制性內切酶將目的基因Pd-lac1與載體pMD18-T Semple Vector進行雙酶切，之后用T4 DNA連接酶將載體與Pd-lac1基因進行連接，獲得重組質粒pPICZB-Pd-lac1，連接液轉化E.coliTop10，涂布在Low Salt LB/Zeocin平板上。隨機選擇轉化子提取質粒，用限制性內切酶對質粒進行酶切分析，轉化后送到生物公司進行測序，驗證目的片斷是否Pd-lac1基因。

1.5 轉化畢赤酵母及鑒定轉化子

pPICZB-Pd-lac1質粒用BglⅡ進行酶切線性化。產物進行凝膠回收，保存備用。Pichiapastoris在YPD平板上分離單菌落，28 ℃培養3 d，挑取酵母單菌落到5 mL YPD培養基中，取100～500 μL轉入100 mL YPD液體培養基中，培養24 h時OD600值為1.1～1.4。獲得細胞并重懸于70 mL冰冷無菌水中， 4 ℃、4 000 r/min離心3 min，重復3次。再將菌體重懸于5 mL冰冷的1 mol/L山梨醇中，4 ℃、4 000 r/min離心3 min。最后用200 μL 1 mol/L冰冷山梨醇懸浮細胞使其終體積為400 μL。獲得感受態細胞存放在冰塊上，當天使用。

將質粒pPICZB-Pd-lac1、0.2 cm電轉杯、酵母感受態細胞放在冰塊上預冷。設置轉化參數：電壓為1 600 V，電擊時間為6 ms。取5～10 μg線性化的重組質粒與60 μL感受態細胞混合，轉至0 ℃預冷的0.2 cm電轉杯中。在2 s之內按PULSE鍵2次，進行電擊轉化，之后轉移到離心管內，28 ℃培養3 h。加入1 mL YPD培養基，28 ℃、180 r/min培養3 h。取100 μL培養物涂布在含Zeocin的YPDS平板上，形成陽性轉化子。

以破壁后的酵母裂解液為模板，用特異性酶切引物進行PCR擴增。反應條件同1.3.2。將PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，驗證Pd-lac1基因是否插入酵母染色體中。

1.6 含漆酶酵母重組子的誘導表達

將正確陽性轉化子菌落和含有空pPICZB載體的對照菌落分別接種至25 mL BMGY液體培養基。28 ℃振蕩培養至吸光值OD600為3～4之間。離心收集菌體，轉入BMMY培養基，28 ℃、180 r/min培養96 h，每24 h加入無水甲醇至終用量為0.5%。每12 h取菌液進行漆酶活性測定。

1.7 漆酶活性測定

1個酶活力單位定義為每分鐘氧化1 μmol底物所需的酶量。420 nm下檢測漆酶與底物在室溫反應3 min的吸光度值。測定反應體系為：空白對照管中加1.95 mL檸檬酸-磷酸鹽緩沖液(pH值為3.4)和50 μL稀釋后的酶液；檢測管中加0.95 mL檸檬酸-磷酸鹽緩沖液(pH值為3.4)，50 μL稀釋后的酶液，1 mL濃度為1 mmol/L的ABTS。測定結果重復3次。

1.8 粗漆酶的制備

將重組菌畢赤酵母pPICZB-Pd-lac1接種到BMGY培養基，27 ℃、240 r/min 振蕩培養15～25 h至吸光值OD600為2～6之間；然后將粗酶液經4 000 r/min，離心12 min，收集沉淀重新懸浮BMMY誘導培養基中，同時添加0.25 mmol/L的CuSO4溶液，振蕩培養，間隔一定時間加入5%甲醇作為誘導物，培養到第3天，離心收集粗酶液，在-80 ℃冰箱中冷凍保存。

1.9 漆酶的純化

對收集的上清液進行超濾濃縮，通過DEAE-Sepharose CL-6B離子交換柱層析，再用聚乙二醇濃縮。收集漆酶蛋白，上樣到凝膠過濾層析柱SephadexG-75上，用pH值為6.5的20 mmol/L醋酸緩沖液進行洗脫，流速設為0.5 mL/min，自動部分收集器收集100管，每管3 mL。對純化的漆酶蛋白用SDS-PAGE進行電泳。

1.10 粗酶液對合成染料的脫色

染料：SN4R，杭州方順化工有限公司；甲基橙，沈陽市新光化工廠公司；孔雀綠，上海撫生實業有限公司；中性紅，天津市大茂化學試劑廠。以上染料分別置于錐形瓶內，放置在干燥、陰涼處妥善保管。

利用紫外-可見分光光度計在300～800 nm區間掃描，得到在此區間4種染料的最大吸收峰值：孔雀綠為558 nm，吸光度=3.511；中性紅為527 nm，吸光度=3.514；甲基橙為486 nm，吸光度=1.876；SN4R為432 nm，吸光度=0.659。脫色體系中加入50 mmol/L(pH值=4.6)檸檬酸-磷酸鹽緩沖溶液1 mL，分別從錐形瓶中吸取1 mL(40 mg/L)待降解4種染料，最后加入重組漆酶酶液1 mL 啟動反應，在25 ℃下靜置反應，每隔一定時間檢測4種染料吸光度值為A1；以同樣方法，反應中加入等量含pPICZB載體的酵母酶液作對照，測其吸光度值為A0。脫色率計算公式為：

2 結果與討論

2.1 漆酶完整CDS序列的PCR擴增

用酶切引物進行PCR擴增，得到Pd-lac1 CDS全長序列，條帶大小為1.6 kb(見圖1)。圖中：泳道1—Marker 2000; 泳道2—對照; 泳道3—樣本。將PCR產物進行凝膠回收，回收大小與PCR結果一致，約1.6 kb，將回收的CDS與載體連接、進行轉化，篩選出陽性轉化子，挑取陽性菌落至含抗性液體LB培養基中進行培養，以菌液為模板進行PCR驗證，結果為單一目的條帶，之后進行質粒提取，同時將菌液送到生物公司測序，進一步驗證是否為漆酶CDS基因。將該序列測序結果輸入到GenBank中Blastx比對后，與其他真菌漆酶基因具有較高的同源性。其中與偏腫革裥菌Lenzitesgibbosa的基因序列同源性評價最高，相似性達86%，與褶孔栓菌Trametesgibbosa、氈毛栓孔菌Trametesvelutina、云芝Trametesversicolor的漆酶基因序列相似性達到77%～79%。GenBank上的登錄號為KF700372。

圖1 Pd-lac1的RT-PCR擴增完整CDS序列結果Fig.1 Pd-lac1 by RT-PCR amplification of complete CDS sequence results

2.2 pPICZB-Pd-lac1表達載體構建及轉化

將帶有自身信號肽漆酶CDS克隆到畢赤酵母表達載體pPICZB的AOX1啟動子下游(見圖2)，表達載體pPICZB-Pd-lac1用EcoRI和XbaI進行雙酶切，得到與漆酶CDS序列大小一致的片段，表明漆酶CDS序列已經插入到表達載體pPICZB中，同時驗證了表達載體pPICZB雙酶切產物(見圖3)。其中泳道1為Marker 15000，泳道2～4為樣本。從Low Salt LB平板上挑取陽性轉化子，進行菌液培養后，提取重組質粒pPICZB-Pd-lac1，進行PCR驗證。將驗證正確的重組酵母菌株接種到含有Zeocin抗性的YPD培養基上，篩選轉化子。在YPD/Zeocin培養基上隨機挑取3個重組酵母單菌落，破壁后分別用帶酶切位點的引物進行PCR驗證(見圖4)。圖中：泳道1為Marker 2000；泳道2為對照；泳道3～5為樣本。

圖2 重組表達載體pPICZB-Pd-lac1結構示意圖Fig.2 Construction of P. djamor expression pPICZB-Pd-lac1

注：1—pPICZB載體質粒雙酶切產物；2—重組質粒雙 酶切驗證結果；3—完整CDS序列擴增結果。圖3 酶切驗證結果Fig.3 Digested validation results

圖4 重組酵母菌落PCR鑒定結果Fig.4 Direct PCR screening of recombinant Pichia colonies

2.3 重組漆酶的誘導表達

分別挑取8株含有重組表達載體pPICZB-Pd-lac1和1株含空載體pPICZB的重組酵母進行培養，從誘導開始，每天檢測重組菌漆酶酶活。從前者發酵液中檢測到漆酶酶活，空載體對照中沒有檢測到。酶活性較高的重組菌株發酵液，在72 h時最高漆酶活性達到54 U/L，之后漆酶活性逐漸下降(見圖5)。

圖5 重組畢赤酵母甲醇誘導表達的漆酶活性Fig.5 Enzyme activity of laecase of recombinant Pichia Pastoris under indueing condition

重組菌株在甲醇誘導下，第3天漆酶活性達到最高(54 U/L)，是原菌株漆酶活性的1.5倍，并且重組菌漆酶誘導時間比原菌株縮短了6 d[12]。近幾年，Flammulinavelutipes[13]、Pycnoporuscinnabarinus[14]、Pleurotussajor-caju[15]、Coriolusversicolor[16]和Trametessp. 420[17]等已經實現異源表達，前3個重組菌株漆酶活性比本研究漆酶活性低；后2個重組菌株漆酶活性比本研究漆酶活性高，可能與表達載體選用自身信號肽有關，以及培養方法和條件因素有關。為提高紅平菇漆酶基因在畢赤酵母中表達的活性，在今后工作中可采取液體發酵罐并實施高密度發酵；或者通過培養基的優化提高重組畢赤酵母pPICZB-Pd-lac1的高密度表達；還可對重組菌株進行純化。通過以上方法，紅平菇漆酶基因異源表達活性會得到進一步提高，從而實現重組菌株分泌目的蛋白在工業生產中的應用。

2.4 漆酶的分離純化

將培養6 d后的重組酵母粗酶液進行超濾，SephadexG-75凝膠層析和DEAE-Sepharose陰離子交換層析純化后經檢測為單一條帶，大小約為62.5 kDa，與預測紅平菇漆酶分子質量大小相似，表明大部分雜蛋白在純化過程中得到去除(見圖6)。圖中：泳道1—對照; 泳道2—樣本; 泳道3—Marker。

圖6 漆酶純化后的SDS-PAGE電泳圖Fig.6 SDS-PAGE of recombinant laccase fron P. pastoris

2.5 重組菌株漆酶Pd-lac1對染料的脫色

分別在4種染料最大吸收峰下檢測其吸光度，從而繪制標準曲線。利用BMMY培養基培養Pd-lac1重組畢赤酵母菌株，當漆酶活性到達最大值時，每間隔12 h吸取1 mL粗酶液，6 000 r/min離心4 min，檢測重組漆酶對不同染料的脫色效率。反應體系：檸檬酸-磷酸鹽緩沖液(pH值3.4)1 mL、粗酶液1.5 mL和不同種染料2.5 mL。反應條件為25 ℃。空白實驗不加粗酶液檢測對染料脫色效率。所有數據均重復3次取平均值。SMD1168H(pPICZB)作對照。

經過計算，Pd-lac1重組畢赤酵母菌株對SN4R的脫色率在24 h達到最大值，為52.8%，對中性紅、甲基橙和孔雀綠在24 h脫色效率達到最大值，分別為14.8%、14.5%和0.24%；而對照組隨著時間變化都沒有檢測到脫色效果，對4種染料脫色效率隨時間變化曲線見圖7。

圖7 Pd-lac1重組畢赤酵母菌株對染料脫色效率結果Fig.7 Decolorization efficiency of Pd-lac1 recombinant Pichia strains on alizarin red (a), neutral red (b), methyl orange (c), and malachite green (d)

3 結 論

隨著人工合成染料的使用量及排放量的逐年上升，環境污染及水體污染問題日趨嚴重。SN4R、甲基橙、中性紅和孔雀綠4種染料在自然水體中很難被生物降解，而且還具有毒性，另外染料還會影響水體的透明度，使水體質量受到嚴重的破壞。本文研究結果顯示，重組菌株漆酶在不需要小分子介體物質的參與情況下，對4種合成染料都具有降解能力。并且對SN4R染料的降解，在24 h脫色率達到53.8%，而原菌株紅平菇粗酶液對SN4R染料在24 h時脫色率為49.4%，證明重組菌株漆酶具有較高的脫色效率；而對中性紅、甲基橙、孔雀綠3種染料的脫色效率較低，因為SN4R屬于蒽醌類染料，化學結構比雜環類中性紅、偶氮類甲基橙和三苯基甲烷類孔雀綠相對簡單，容易分解，因此重組菌株漆酶對SN4R染料脫色具有較大的應用潛力，進而對含蒽醌類染料廢水處理具有更好的應用前景。

總之，本文研究從Pleurotusdjamor克隆了一條漆酶基因，并實現了在畢赤酵母中的異源表達及重組漆酶對不同染料的脫色效率，為進一步研究異源表達優化后染料脫色及重組漆酶純化奠定了基礎。

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