高效液相色譜法測(cè)定硝苯地平片含量的方法學(xué)研究

趙靈芝，劉春葉，王海洋，苗延青，張雪嬌

(西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，陜西 西安 710021)

硝苯地平是第一代鈣拮抗劑，為抗高血壓、防治心絞痛藥物，是20世紀(jì)80年代中期的暢銷(xiāo)藥物之一。該藥的特點(diǎn)是起效快、峰/谷比值高，導(dǎo)致了神經(jīng)體液活化，經(jīng)多年臨床使用，療效得到了肯定[1-4]。中國(guó)藥典二部(2005年版)中收載的硝苯地平片含量測(cè)定方法為紫外可見(jiàn)分光光度法[5-7]，該法較繁瑣，并且分次定量轉(zhuǎn)移時(shí)容易造成損失;此外，硝苯地平遇光極不穩(wěn)定，分子內(nèi)部易發(fā)生光化學(xué)歧化作用而降解為硝基苯吡啶衍生物及亞硝基苯吡啶衍生物，因此，用紫外可見(jiàn)分光光度法測(cè)定硝苯地平的含量可導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果偏高。為客觀、準(zhǔn)確地反映硝苯地平片的實(shí)際含量，作者參照已報(bào)道硝苯地平的測(cè)定方法[8-12]，建立測(cè)定硝苯地平片含量的HPLC法，并進(jìn)行了方法學(xué)考察，擬為進(jìn)一步完善硝苯地平片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和合理利用提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試藥、試劑與儀器

硝苯地平標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，中國(guó)藥品生物制品檢定所；硝苯地平片：(1)江蘇制藥股份有限公司，揚(yáng)子江藥業(yè)，批號(hào)：12031501、12072701、12083001，規(guī)格：每片10 mg；(2)南京白敬宇制藥有限責(zé)任公司，利煥藥業(yè)，批號(hào)：110911、120307、120601，規(guī)格：每片10 mg；(3)浙江泰利森制藥有限公司，納欣同藥業(yè)，批號(hào)：120302、120406、121008，規(guī)格：每片20 mg。

甲醇，色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；純凈水，娃哈哈食品有限公司。

Agilent 1260型高效液相色譜儀，安捷倫科學(xué)儀器有限公司；UV-2102 Pcs型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海優(yōu)尼科儀器有限公司；YP50001型電子分析天平，上海越平科學(xué)儀器有限公司；KQ5200E型超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵，鞏義予華儀器有限責(zé)任公司。

1.2 色譜條件[8-12]

色譜柱：Agilent C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫25 ℃；流動(dòng)相：甲醇-水(60∶40，體積比)，流速0.8 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)235 nm；進(jìn)樣量20 μL。

1.3 方法

1.3.1 硝苯地平對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備

精密稱(chēng)取硝苯地平對(duì)照品0.0050 g，用甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中，搖勻，得0.5 mg·mL-1硝苯地平對(duì)照品儲(chǔ)備液，在4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 硝苯地平供試品溶液的制備

取硝苯地平10片，除去糖衣，精密稱(chēng)定，研細(xì)，精密稱(chēng)取適量置于燒杯中，加甲醇適量超聲溶解，過(guò)濾，取續(xù)濾液定容于10 mL容量瓶中，得供試品溶液。

1.3.3 定量限實(shí)驗(yàn)

將硝苯地平對(duì)照品儲(chǔ)備液分別稀釋5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍，得濃度為100 μg·mL-1、50 μg·mL-1、25 μg·mL-1、17 μg·mL-1、12.5 μg·mL-1、10 μg·mL-1、8.3 μg·mL-1的對(duì)照品溶液，在1.2色譜條件下進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.4 檢測(cè)限實(shí)驗(yàn)

將硝苯地平的對(duì)照品儲(chǔ)備液分別稀釋40倍、60倍、80倍、100倍，得濃度為12.5 μg·mL-1、8.3 μg·mL-1、6.25 μg·mL-1、5 μg·mL-1的對(duì)照品溶液，在1.2色譜條件下進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用移液管精密移取硝苯地平對(duì)照品儲(chǔ)備液(c=0.5 mg·mL-1)250 μL、500 μL、1 mL、2 mL、4 mL、8 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成濃度分別為12.5 μg·mL-1、25 μg·mL-1、50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、200 μg·mL-1、400 μg·mL-1的硝苯地平標(biāo)準(zhǔn)溶液，在1.2色譜條件下進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.6 精密度實(shí)驗(yàn)

精密移取硝苯地平對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL，用甲醇定容到10 mL容量瓶中，得50 μg·mL-1硝苯地平對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算RSD值。

精密移取硝苯地平對(duì)照品儲(chǔ)備液250 μL，用甲醇定容到10 mL容量瓶中，得12.5 μg·mL-1硝苯地平對(duì)照品溶液，在1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算RSD值。

精密移取硝苯地平對(duì)照品儲(chǔ)備液2 mL，用甲醇定容到10 mL容量瓶中，得100 μg·mL-1硝苯地平對(duì)照品溶液，在1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算RSD值。

1.3.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取供試品溶液于室溫下放置0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h后進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算RSD值。

1.3.8 回收率實(shí)驗(yàn)

取已知含量的超聲提取液樣品3份，精密加入濃度為80 μg·mL-1的硝苯地平對(duì)照品溶液1 mL、2 mL、3 mL，用甲醇重新配制到標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍，在1.2色譜條件下進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算回收率。

1.3.9 硝苯地平含量測(cè)定

取3個(gè)不同廠家、9個(gè)不同批次的硝苯地平供試品溶液在1.2色譜條件下進(jìn)行檢測(cè)，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

以甲醇作參比，將濃度為0.5 mg·mL-1的硝苯地平對(duì)照品甲醇溶液在紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)上進(jìn)行紫外吸收光譜掃描。結(jié)果顯示硝苯地平在235～240 nm處有較大吸收，且235 nm處干擾較小，峰型對(duì)稱(chēng)，基線平穩(wěn)。因此，確定測(cè)定波長(zhǎng)為235 nm。

2.2 流動(dòng)相的確定

本實(shí)驗(yàn)流動(dòng)相采用中國(guó)藥典二部(2010年版)中測(cè)定硝苯地平片含量所用的甲醇-水(60∶40，體積比，下同)[7]，以0.5 mg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液進(jìn)樣得色譜圖，見(jiàn)圖1。

圖1 以甲醇-水(60∶40，體積比)為流動(dòng)相的色譜

由圖1可知，以甲醇-水為流動(dòng)相時(shí)，硝苯地平峰的保留時(shí)間為6～10 min，理論塔板數(shù)(以硝苯地平峰計(jì))不低于4 000，其對(duì)稱(chēng)因子為1.05，與雜質(zhì)峰的分離度不小于2.0。硝苯地平基線穩(wěn)定、峰型好、對(duì)稱(chēng)性好、柱效高。因此，確定流動(dòng)相為甲醇-水(60∶40)。

2.3 定量限和檢測(cè)限

定量限實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，硝苯地平濃度為10 μg·mL-1時(shí)，信噪比(S/N)≥10，確定定量限為10 μg·mL-1。

檢測(cè)限實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，硝苯地平濃度為6.25 μg·mL-1時(shí)，信噪比(S/N)≥3，確定檢測(cè)限為6.25 μg·mL-1。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以硝苯地平質(zhì)量濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖2。進(jìn)行擬合回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=62533x-137.65，R=0.9999。表明硝苯地平在12.5～400 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，而其它文獻(xiàn)報(bào)道的硝苯地平線性范圍為40～140 μg·mL-1，所以，本實(shí)驗(yàn)中HPLC法測(cè)定硝苯地平的定量限更低。

圖2 HPLC法測(cè)定硝苯地平的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 精密度

精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：峰面積的RSD值為1.08%(n=6)，說(shuō)明該方法的精密度高；日內(nèi)精密度測(cè)定的峰面積的RSD值為1.56%(n=6)，說(shuō)明該方法的日內(nèi)精密度較好。日間精密度測(cè)定的峰面積的RSD值為0.79%(n=7)，說(shuō)明該方法的日間精密度較好。

2.6 穩(wěn)定性

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，峰面積的RSD值為2.72%(n=8)，說(shuō)明該溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 回收率(表1)

表1硝苯地平回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.1Results of nifedipine recovery experiment

由表1可知，在低、中、高3個(gè)濃度下的平均回收率分別為99.23%、99.99%、101.66%，符合要求。

2.8 硝苯地平含量測(cè)定

對(duì)9種供試品溶液按照1.2色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知，不同廠家、不同批次硝苯地平片中硝苯地平含量均符合標(biāo)注規(guī)格，揚(yáng)子江藥業(yè)、利煥藥業(yè)、納欣同藥業(yè)硝苯地平含量分別為標(biāo)注規(guī)格量的114.03%、113.40%、123.13%。

表2硝苯地平片的含量測(cè)定結(jié)果

Tab.2Nifedipine tablets assay results

3 結(jié)論

建立了一種快速測(cè)定硝苯地平片含量的HPLC 方法，對(duì)其進(jìn)行方法學(xué)考察。色譜條件如下：采用Agilent C18柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)，以甲醇-水(60∶40，體積比)為流動(dòng)相，流速0.8 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)235 nm，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量20 μL。結(jié)果表明，硝苯地平在12.5～400 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量限更低，精密度和穩(wěn)定性也較好，而且加樣回收率符合要求。用此HPLC法對(duì)3個(gè)不同廠家、9個(gè)不同批次的硝苯地平片進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，各廠家不同批次硝苯地平片中硝苯地平含量均符合標(biāo)注規(guī)格，揚(yáng)子江藥業(yè)、利煥藥業(yè)、納欣同藥業(yè)硝苯地平含量分別為標(biāo)注規(guī)格量的114.03%、113.40%、123.13%。該法專(zhuān)屬性強(qiáng)、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確、快速簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性好，是測(cè)定硝苯地平含量的有效方法，可為控制硝苯地平片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和合理利用提供依據(jù)。

[1] 孫寧玲.心腦器官的保護(hù)基礎(chǔ)是血壓充分的達(dá)標(biāo)[J].心血管病學(xué)進(jìn)展,2006,27(5):543-545.

[2] 葛慶華,王浩,傅民,等.國(guó)產(chǎn)硝苯地平控釋片的藥動(dòng)學(xué)和生物等效性研究[J].高血壓雜志，2005,13(5):310-312.

[3] 武文英,王文華,張嘉.硝苯地平緩釋片與硝苯地平控釋片的降壓療效觀察[J].心血管康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志,2008,17(3):278-282.

[4] 李鳳云,趙立軍.硝苯地平控釋片和硝苯地平緩釋片對(duì)血壓波動(dòng)性的影響[J].實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2009,16(4):1283-1284.

[5] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(二部)[M].2000年版.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2000:836.

[6] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(二部)[M].2005年版.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005:704.

[7] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(二部)[M].2010年版.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010:944.

[8] 付居標(biāo),喬麗.硝苯地平的HPLC測(cè)定[J].山東醫(yī)藥工業(yè),2001,20(5):10-11.

[9] 高巖,裘一蘭,董莉.HPLC法測(cè)定硝苯地平片的含量[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2008,30(4):346-348.

[10] 沙振方,高海,孫文基.硝苯地平及有關(guān)雜質(zhì)的HPLC測(cè)定法[J].中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志,1993,24(4):176-179.

[11] 段萍.HPLC法測(cè)定硝苯地平糖衣片中硝苯地平的含量[J].中國(guó)藥事,2007,21(11):899-901.

[12] PATEL D P,SHARMA P,SHRIVASTAV P S.Highly sensitive and rapid ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for the determination of nifedipine in human plasma and its application to a bioequivalence study[J].Biomedical Chromatography,2012,26(12):1509-1518.