穴位埋線對VD大鼠學習記憶能力及血清Livin表達的影響*

劉 俊， 唐中生， 王興桂， 謝高宇， 陳 波， 羅亞非

(1.貴陽中醫學院研究生院， 貴州 貴陽 550002； 2.貴陽中醫學院基礎醫學院， 貴州 貴陽 550002；3.貴陽中醫學院針灸推拿系， 貴州 貴陽 550002)

血管性癡呆(vascular dementia，VD)是由一系列腦血管因素(缺血、出血、急慢性缺氧性腦血管病等)導致腦組織損害引起的以認知功能障礙為特征的癡呆綜合征[1]，已成為威脅高齡人群生命的疾病之一。細胞凋亡是血管性認知功能損害重要的病理生理機制，認知功能損害程度與細胞凋亡有著直接的聯系。目前細胞凋亡在腦血管病發病機制中受到重視，多種細胞因子作為啟動因素引起缺血性腦損傷。Livin是近年發現的凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein family，IAPs)家族新成員，具有較強的抗凋亡活性。本研究制備VD大鼠模型，采用穴位埋線治療，觀察VD大鼠血清Livin水平，探討穴位埋線治療VD的可能機制，為臨床治療VD提供一定的實驗依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康雄性SD大鼠70只，體重280～300 g，清潔級，由重慶滕鑫比爾實驗動物銷售有限公司提供，許可證號：SCXK(渝)2007-0006。

1.1.2 實驗器材 可吸收性外科縫線(經絡疏通專用線)(中國中醫研究院眾益科技開發公司)；電子天平(蘇州精密儀器廠)；DigBehv Morris 水迷宮視頻分析系統(上海吉量軟件科技有限公司)；微型動脈夾(安徽淮北正華生物儀器設備有限公司)；SDQ-30雙極射頻電凝器(蘇州手術器械廠)；一次性1mL注射針頭、一次性5mL注射針頭(江西洪達醫療器械集團有限公司)。

1.1.3 藥品與試劑 水合氯醛、4%多聚甲醛、兔抗大鼠Livin抗體(美國R&D Systems 公司生產)檢測試劑盒(貴州平生生物技術有限公司提供)、尼莫地平片(正大青春寶藥業有限公司生產，批號：0801002)。

1.2 方法

1.2.1 VD大鼠模型的建立 將大鼠隨機分為假手術組、VD模型組、穴位埋線組和尼莫地平組，采用改良的Pulsinelli’s四血管阻斷法(four-vessel occlusion，4-VO)建立VD大鼠模型[2]。模型制作成功標準：大鼠在4條血管阻斷后1-2 min內，翻正反射消失，虹膜變白及瞳孔散大。

1.2.2 治療方法 術后第7天開始治療，除穴位埋線組外，其余各組治療均在每天上午9：00～11：00進行，每日1次，連續治療15 d。

1.2.2.1 穴位埋線組 穴位選擇：百會、膈俞、氣海、三陰交、膻中。穴位定位：以《實驗針灸學》定位位置為標準[3]。治療方法：將可吸收性外科縫線(4～0號)剪成2 mm小段若干，放在已消毒紙上備用。使用時用鑷子將其裝入1 mL的注射針頭，然后再將預先剪去針尖的針灸針作為針芯穿入注射針頭內，組成一套埋線工具。埋線時，先以碘酒消毒，乙醇脫碘后，將注射針頭刺入穴位，然后抵住針灸針針尾作注射狀，迅速將針頭內的羊腸線推入穴內，感覺注射針內有空虛感時方可出針，并確認羊腸線已埋入穴位內。

1.2.2.2 尼莫地平組 按20 mg/(kg·d)的用量進行灌胃治療。

1.2.2.3 假手術組、VD模型組均給予蒸餾水1 mL/100 g灌胃。

1.2.3 Morris 水迷宮學習記憶能力檢測[4]各組大鼠于術后第28 d開始水迷宮測試。Morris水迷宮為圓形水池，直徑100 cm，深50 cm，水深30 cm，水溫(24±2)℃，池壁上4個等距離點分水池為四個象限，選第三象限在其中央放置平臺，平臺無色透明，直徑6 cm，高28 cm，平臺沒于水面下2 cm，水池周圍參照物保持不變。第1～6 d進行定向航行實驗，每日將大鼠按Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限的順序從各入水點(各象限水池壁中點)靠池壁放入水中，記錄60 s內大鼠從水中爬上站臺所需時間為逃避潛伏期；第7 d行空間探索實驗，將大鼠從第Ⅰ象限入水點放入水池，記錄2 min內大鼠在第Ⅲ象限游泳時間和穿越站臺次數。

1.2.4 血清采集及檢測 Morris 水迷宮檢測之后，于腹股溝處切開皮膚，剪斷股動脈采集血液，入冰箱靜置過夜后采集血清以備進行Livin含量檢測。開顱取腦，取海馬組織固定12 h。經梯度酒精脫水、透明、浸蠟、包埋后，連續冠狀切片(片厚5 um)。蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察海馬神經元的病理變化。

2 結果

2.1 穴位埋線對VD大鼠Morris水迷宮的影響

2.1.1 定位航行實驗 平均逃避潛伏期反映大鼠的學習能力。模型組大鼠平均逃避潛伏期與假手術組比較明顯延長(P<0.05或P<0.01)，穴位埋線組與模型組相比，平均逃避潛伏期縮短(P<0.01)，與尼莫地平組無比較意義(P>0.05)。結果見表1。

表1 各組大鼠每天平均逃避潛伏期的測試

注：與假手術組比較，△P<0.01；與模型組比較，﹡P<0.05，﹡﹡P<0.01

2.1.2 空間探索實驗 該實驗反映了大鼠的記憶能力。VD模型組與假手術組比較，第Ⅲ象限活動時間縮短、穿越站臺次數減少(P<0.01)，穴位埋線組與VD模型組比較，第Ⅲ象限活動時間延長、穿越站臺次數增多(P<0.01，P<0.05)，穴位埋線組與尼莫地平組無比較意義(P>0.05)。結果見表2。

表2 各組大鼠空間探索實驗第Ⅲ象限活動時間、

注：與假手術組比較，△P<0.01；與模型組比較，△△P<0.01；與假手術組比較，﹡P<0.01；與模型組比較，﹡﹡P<0.05

2.2 穴位埋線對VD大鼠血清livin含量的影響 VD模型組大鼠血清Livin含量比假手術組顯著降低(P<0.01)，穴位埋線組大鼠血清Livin含量雖然也低于假手術組(P<0.05)，但與VD模型組大鼠相比明顯升高(P<0.05)，結果見表2。穴位埋線可以提升VD大鼠異常降低的血清Livin含量，提示其改善VD大鼠的學習記憶能力與升高其血清Livin含量有關。

2.3 穴位埋線對VD大鼠病理形態學的影響 HE染色見假手術組大鼠海馬CA1區神經元排列整齊、密集，無變性、壞死和腫脹細胞結構正常，胞漿豐富，無膠質細胞增生現象；細胞核呈圓形、橢圓形。(見Fig.1圖A)；VD模型組海馬組織明顯水腫，血管擴張充血，并見嚴重的神經元腫脹、變性及壞死，神經纖維增粗紊亂。(見Fig.1圖B)；穴位埋線組海馬CA1區現輕微水腫、血管擴張充血，神經元出現腫脹及變性，未見神經元排列紊亂和壞死。(見Fig.1圖C)；尼莫地平組海馬CA1區神經元密集，出現輕微水腫和血管擴張充血，神經元現輕微腫脹和變性，未見神經元排列紊亂和壞死，神經纖維現增粗紊亂。(見Fig.1圖D)。

Fig.1 各組大鼠海馬CA1區神經元病理形態學觀察

3 討論

近年來的研究表明，腦缺血可引起腦神經細胞凋亡及其相關基因的表達，并認為細胞凋亡在缺血損傷中起重要作用。越來越多的證據表明：基因調控與細胞凋亡有關。影響細胞凋亡的基因按其表達物對凋亡過程的作用大致可分為兩類：存活基因和致死基因。Livin是一種新近發現的抗細胞凋亡因子，以其為靶點的抑制物及反義Livin能夠保護細胞不進行凋亡[5]。還有報道稱Livin能夠作用于細胞凋亡線粒體通路，發揮抑制細胞凋亡的作用[6]。抑制凋亡的的機制主要通過：抑制Caspasep途徑、激活TAK1/JNK1信號傳導途徑來實現[5]。譚家澤等[7]通過對Livin檢測顯示VD患者Livin含量降低，提示Livin低表達參與了VD的細胞凋亡進程。張益等[8]對大鼠腦缺血再灌注腦組織Livin表達的研究顯示，假手術組、正常組Livin陽性細胞數量極低，模型組Livin陽性細胞數明顯增加，治療后，Livin陽性細胞數增加，表明通過增加Livin表達，可對細胞凋亡產生抑制作用，減輕神經元的丟失。本研究發現，模型組VD大鼠Livin含量降低，與譚家澤的臨床試驗結果相一致。進一步觀察發現，與模型組比較，埋線組可以提升VD大鼠異常降低的血清Livin含量，緩解海馬神經元細胞損傷。

穴位埋線療法屬于針灸療法的一個分支，是經絡理論與現代醫學手段相結合的產物，是在中醫理論指導下，采用不同型號的羊腸線，根據需要有選擇地埋入穴位，通過羊腸線對穴位的持續刺激作用，達到治療疾病的一種外治方法，已經廣泛應用于臨床各科[9]。由于VD是一種需要長期治療的疾病，目前針刺療效肯定，而穴位埋線每20～30 d治療1次，故避免需較長時間每日針刺的痛苦，使家屬及患者更能堅持長期的治療，所以穴位埋線不失為一種較為切實的治療方法。中醫認為，癡呆病人多屬本虛標實，氣虛血瘀。氣虛則神失所養，瘀血則可隨經脈流行入腦，與精髓錯雜，致使清竅受蒙，靈機呆鈍而出現神識不清，表情癡呆諸癥。筆者選取百會、膈俞、氣海、三陰交(雙)、膻中組成益氣活血方。百會為諸陽、百脈之會，可開竅醒神、回陽固脫。膈俞有開胸通膈治療氣滯血瘀之功。氣海培補元氣。三陰交可健脾益氣，調補肝腎。膻中為氣會，有理肺氣、通乳絡之功。以上五穴共同組合，共奏益氣活血之功。本實驗以此為基礎，運用穴位埋線治療實驗性VD大鼠，觀察大鼠血清Livin含量變化與埋線治療的療效關系，為臨床運用穴位埋線治療VD提供一定的理論依據。

Morris水迷宮已經廣泛地用于動物空間學習記憶研究的實驗。空間學習記憶是檢測動物空間方向、反射時間、視知覺和結構應用等能力，從而評價其認知水平的一種行為模式，是一類關于場景和事件的學習記憶，因能較好地檢測到實驗動物的空間學習記憶功能，并有排除動物在完成作業而經過的途中所留下的排泄物和所分泌的外激素對其它動物作業成績產生影響等優點，因而在國內外被廣泛采用[10]。本實驗采用經典的4-VO建立VD模型。結果發現，模型組大鼠找到站臺的時間比對照組大鼠明顯延長；第7天撤去站臺后，VD模型組大鼠第Ⅲ象限游泳時間和穿越站臺次數比對照組明顯減少，結果表明，模型組大鼠學習記憶能力較對照組明顯減退，應用4-VO改良法成功復制了VD模型大鼠。采用穴位埋線治療后，大鼠找到站臺的時間較VD模型組明顯縮短，學習記憶成績接近對照組，提示穴位埋線能有效改善VD大鼠的學習記憶能力。

結果顯示，VD模型組血清Livin顯著低于假手術組，穴位埋線組與VD模型組相比，具有顯著性差異(P<0.01)，與尼莫地平組相比，無顯著性差異(P>0.05)。病理結果顯示，VD模型組海馬CA1區神經元嚴重受損，導致學習記憶能力降低，穴位埋線組海馬CA1區神經元恢復良好，無嚴重變性和壞死，說明穴位埋線可緩解腦缺血性損傷的神經細胞凋亡，從而改善學習記憶。本研究結果表明，提升血清Livin含量，緩解腦缺血后細胞凋亡，減輕海馬神經元的損傷，可能是穴位埋線改善癡呆癥狀的機理之一。

參考文獻：

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[8]張益，蔡志友，晏勇.阿托伐他汀對大鼠腦缺血再灌注腦組織Livin、caspase 3表達的影響[J].重慶醫學，2009，9(37)：1112-1114.

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