海濱雀稗液泡膜H＋－PPase（PvVP1）5′端的克隆和序列分析

宋輝，南志標＊，蔡小寧，鐘小仙，顧洪如

（1.草地農業生態系統國家重點實驗室 蘭州大學草地農業科技學院，甘肅 蘭州730020；2.南京曉莊學院生物化工與環境工程學院，江蘇 南京211171；3.江蘇省農業科學院畜牧研究所，江蘇 南京210014）

焦磷酸酶（pyrophosphatase，PPase，EC3.6.1.1）是以焦磷酸為底物的水解酶，該酶廣泛地存在于自然界中，參與合成糖類、核酸和蛋白質等多種代謝途徑中所形成的焦磷酸的水解。PPase通常分為2類，一類是存在于細胞質和細胞器基質中的可溶性酶類，即無機焦磷酸酶（inorganic pyrophosphatase）；另一類是與膜結合的不可溶性酶類，也就是膜結合焦磷酸酶（V－PPase）［1］。植物中主要存在3種質子泵（H＋－ATPase），即位于細胞質膜上的P型質子泵（P－ATPase）、液泡膜上的V型質子泵（V－ATPase）和 H＋－轉運無機焦磷酸酶（H＋－PPase）［2］。在鹽脅迫條件下，植物V－H＋－ATPase和V－H＋－PPase一起為液泡膜Na＋/H＋逆向轉運蛋白提供質子驅動力，將細胞質中過多的Na＋區域化于液泡中，從而減輕Na＋的毒害［3］。

20世紀50年代，Kunitz［4］首次從酵母中純化到無機焦磷酸酶，隨后，Karlsson［5］從甜菜（Betavulgaris）根的膜制劑中分離到鉀激活的V－PPase。但是，直到1992年，Sarafian等［6］才從擬南芥（Arabidopsisthaliana）的cDNA文庫中第一次克隆出完整的液泡膜H＋－PPase的cDNA序列，命名為AVP1（M81892）。隨后，研究者發現，大多數陸生植物H＋－PPase cDNA含有2283～2319個核苷酸的開放閱讀框架（ORF），編碼大約761～722個氨基酸殘基，計算出的分子量約為80～81kDa。另外，研究者比較了11種不同陸生植物的液泡膜H＋－PPase氨基酸序列發現，它們的同源性高達86%～91%［7－8］。現在普遍認為，液泡膜H＋－PPase是由單基因編碼，它的過量表達很有可能會增加質子力而提高植物的耐鹽性。異源表達擬南芥液泡膜H＋－PPase恢復了鹽敏感酵母突變體的耐鹽性，鹽芥的液泡膜TsVP轉入陸地棉（Gossypiumhirsutum）后使其比同型野生型植株在150和250 mmol/L NaCl處理下耐受性增強［9－10］。席杰軍等［11］和 Wu等［12］成功地從多漿旱生霸王（Zygophyllumxanthoxylum）中克隆了液泡膜H＋－PPase并證實該基因對霸王響應鹽堿和干旱脅迫具有重要作用。

海濱雀稗（Paspalumvaginatum）又名夏威夷草，隸屬于禾本科雀稗屬植物，原產于熱帶和亞熱帶濱海地帶。海濱雀稗分蘗密度高，生長旺盛，具有較強的抗逆性和廣泛適應性，耐鹽堿的性能尤為出眾，可以使用海水澆灌。因此，筆者認為，從海濱雀稗中克隆出相應的耐鹽基因，然后將目的基因轉入非鹽生牧草中以提高其耐鹽性是可行的。

1 材料與方法

1.1 材料

海濱雀稗于2011年6月份在溫室中培養；大腸桿菌（Escheriachiacoli）DH5α；BU－SuperScript RT KIT、IPTG和X－Gal購自Biouniquer；pMDTM18－T Vector購自TaKaRa；Phusion High－Fidelity DNA Polymerase購自NEB（北京）有限公司；膠回收試劑盒，Marker購自北京天根生化；RNA提取試劑盒，加A反應液購自蓋寧生物科技（北京）有限公司，引物合成和序列測定由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

1.2 海濱雀稗總RNA的提取

依據RNA pure超純總RNA快速提取試劑盒的說明書進行。

1.3 海濱雀稗中間片段的克隆

將提取的總RNA使用BU－SuperScript RT KIT試劑盒反轉錄成cDNA。以反轉錄的cDNA為模板，P1：GGYGGDTCBTCHATGGCYCT，P2：AYTTCTTDGCRTTRTCCC為引物進行PCR。將目的片段回收純化，送南京金斯瑞生物科技有限公司進行序列測定。

1.4 海濱雀稗PvVP15′RACE的克隆

按照Biouniquer的反轉錄試劑盒說明書操作步驟進行，略加修改，先合成5′－RACE－Ready cDNA。根據所獲得的海濱雀稗液泡膜H＋－PPase基因部分cDNA序列信息，利用Primer Premier 5.0軟件設計特異性引物GSP1：5′－AGAGACCAACCGCCACACACAAGAACA－3′；再設計1個5′端巢式PCR引物 GSP2：5′－GAGCAGCACAAGACGATTCAGCA－3′。通過2次PCR獲得5′RACE擴增產物，通過2%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產物，切下條帶提取純化，用于后續實驗。

1.5 序列分析

將5′RACE擴增得到的片段連接到pMD18－T載體上，轉入大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆子，提交南京金斯瑞生物科技有限公司進行序列測定。測序結果應用DNAstar、ContigExpress、Clustal x、MEGA4.0和NCBI網站上的BLAST比對工具分析。

2 結果與分析

2.1 海濱雀稗RNA的提取和鑒定

提取海濱雀稗葉片的總RNA，經過1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，可清晰觀察到，28SrRNA與18S rRNA的條帶亮度基本呈1∶1。結果顯示，提取的海濱雀稗總RNA符合實驗要求（圖1）。

圖1 海濱雀稗總RNA的提取與鑒定Fig.1 Extraction and identification of P.vaginatumRNA

2.2 海濱雀稗PvVP1中間片段的擴增

以海濱雀稗cDNA為模板，P1，P2為引物進行RT－PCR擴增。電泳顯示在1391bp存在一條明顯的亮帶，命名為PvVP1（圖2）。

2.3 海濱雀稗PvVP1 5′RACE的擴增

使用5′RACE巢式PCR，擴增產物于2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。由圖3可知，在500和750bp之間有一條明亮的條帶。經測序可知，目標條帶序列長697bp。

2.4 海濱雀稗PvVP1 5′RACE序列的分析

通過對海濱雀稗PvVP1中間片段和5′RACE擴增產物序列的測定，經序列拼接（圖4），該片段ORF核苷酸序列長1605bp，共編碼535個氨基酸殘基。通過BLAST對比發現：海濱雀稗PvVP1的核苷酸序列與玉米（Zeamays）相應基因的核苷酸序列同源性達到93%，而與其他植物的相關序列同源性也達到79%以上，與玉米氨基酸的同源性高達99%。

圖2 海濱雀稗PvVP1中間片段PCR擴增結果Fig.2 PCR amplification result of P.vaginatummiddle fragment

圖3 巢式PCR電泳結果Fig.3 The nested PCR products

圖4 核苷酸序列及所編碼的氨基酸序列Fig.4 Nucleotide sequence and the deduced amino acid sequence

將通過推測得到的PvVP1氨基酸序列與其他植物的氨基酸進行多重比對發現（圖5），它與其他植物的氨基酸的保守區域多達495個，而不保守區域為40個。其中，與大麥（Hordeumvulgare）和水稻（Oryzasativa）的相似性為98%，與小麥（Triticumaestivum）的相似性為97%，與卡拉草（Leptochloafusca）和高粱（Sorghumbicolor）的相似性為95%。

通過使用MEGA 4.0構建PvVP1的系統發育樹顯示（圖6），海濱雀稗PvVP1與玉米的親緣關系最近，與水稻的親緣關系次之，與萊茵衣藻（Chlamydomonasreinhardtii）和鹽藻（Dunaliellaviridis）的親緣關系較遠。

圖5 PvVP1氨基酸序列與其他植物H＋－PPase氨基酸序列的多重比對Fig.5 The alignment of the amino acid sequence of PvVP1and H＋－PPase from other plants

3 討論

植物在漫長的進化過程中，逐漸形成了通過減少鹽分的攝入、增強鹽分的外排或使Na＋區域化進入液泡而避免鹽害的脅迫［13］。目前，研究者主要利用以上3種機制來增強陸地棉［10］、水稻［14］、煙草［15］（Nicotianatabacum）等經濟作物的耐鹽性，而在牧草方面的研究鮮見報道。近年來，隨著草地退化的趨勢日益嚴重，生態環境的惡化日漸突出，為了改善生態條件和提高鹽堿地區城鄉的綠化以及選育優良的牧草顯得越來越重要［16－17］。我國的研究者在此方面做出了巨大的貢獻，尤其是在結縷草［18］（Zoysiajaponica）、象草［19］（Pennisetumpurpureum）、狗牙根［20］（Cynodondactylon）等方面的研究已具有一定的影響力，但是利用基因工程的手段研究海濱雀稗的報道較少。2009年，鄒軼等［21］通過研究海鹽脅迫對海濱雀稗生長的影響表明，海濱雀稗對鹽脅迫有較強的抗性。正是基于此研究，筆者認為，海濱雀稗的較強耐鹽性很有可能是由體內的某些基因的上調表達造成的。因此，本實驗室試圖利用分子生物學技術對海濱雀稗的耐鹽基因進行挖掘，以期通過轉基因技術將海濱雀稗良好的耐鹽基因轉化耐鹽性較差的牧草中，最終培育出適合在鹽堿地生長的牧草。

圖6 海濱雀稗PvVP1的系統發育樹Fig.6 The phylogenetic tree of PvVP1

目前普遍將液泡膜H＋－PPase基因分為2種類型，即I型和II型［22－23］。在擬南芥中的研究發現，這2種類型的相似性只有36%，而且這2種類型的H＋－PPase基因不是簡單的同工酶關系，它們分布在液泡膜的不同部位，發揮不同的生理功能［24］。目前的研究表明，I型基因在植物的耐鹽性中發揮重要的作用。本研究利用5′RACE技術快速克隆了海濱雀稗液泡膜H＋－PPase基因，通過氨基酸比對發現，該基因與其他植物I型基因的氨基酸序列非常相似，說明所得到的克隆是液泡膜H＋－PPase基因家族I類型。

在綠色植物和藻類植物的液泡膜H＋－PPase基因中保守的GGG、KAADVGADLVGKVE、DNVGDNVGD、YYTS等基序在漫長的進化中一直未丟失，這被認為是液泡膜 H＋－PPase酶的催化位點［7，25－26］。由于DVGADLVGKVE和DNVGDNVGD具有Gly（G）、Ala（A）、Asp（D）、Val（V）四種保守的氨基酸，因此這2種保守的基序不僅在進化上具有重要的意義；而且在液泡膜H＋－PPase酶發揮生理功能時，也起著非常重要的作用［26］。本試驗已成功地克隆到了上述4個保守的基序（圖4），這表明海濱雀稗PvVP1具有液泡膜質子泵的功能。由前人的研究表明，液泡膜H＋－PPase基因I型受 Mg2＋和K＋的激活［7］，并且Asp（D）和Glu（G）被認為是最佳的金屬離子螯合位點［27］。因此，筆者推測，DVGADLVGKVE和DNVGDNVGD這2個最為保守的基序最有可能是海濱雀稗PvVP1與Mg2＋和K＋的結合位點和發揮生理功能的催化位點。

通過以上對海濱雀稗PvVP1 5′末端序列的分析，筆者認為，海濱雀稗PvVP1具有良好的耐鹽性。本實驗室已準備下一步克隆海濱雀稗PvVP1的3′末端，從而克隆出PvVP1的全長序列用于轉化優良牧草，以提高其耐鹽性。

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