RNAi沉默Skp2抑制胃癌細(xì)胞SGC7901侵襲作用的實(shí)驗(yàn)研究

張連峰，魏 爭(zhēng)，韓利坤，張緒文，喬海泉

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院普通外科,哈爾濱 150001)

胃癌是一種常見的消化道腫瘤，全球發(fā)病率居惡性腫瘤的第五位，病死率居惡性腫瘤的第三位[1]。在發(fā)展中國(guó)家，胃癌的5年生存率<20%，意味著>80%的胃癌患者存在復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的可能[1]。近年來(lái)，基因靶向治療已經(jīng)逐步成為新的腫瘤診斷和治療手段，并且取得初步成果[2]。S期激酶相關(guān)蛋白2(Sphase kinaseassociated protein 2,Skp2)在大量實(shí)體腫瘤中呈高表達(dá)，現(xiàn)已證實(shí)其具有癌基因的潛能并與惡性腫瘤的分化程度及預(yù)后密切相關(guān)[3]。本研究使用RNAi沉默Skp2，觀察其對(duì)胃癌細(xì)胞株SGC7901侵襲能力的影響，為胃癌的基因靶向治療提供新的策略和途徑。

1 材料與方法

1.1材料 SGC7901胃癌細(xì)胞株購(gòu)自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心，質(zhì)粒由日本廣島大學(xué)Yasusei Kudo教授惠贈(zèng)，Skp2羊抗人抗體、p21小鼠抗人抗體、p27小鼠抗人抗體、Kazal基序逆向誘導(dǎo)半胱氨酸豐富蛋白(reversion-inducing cysteine rich protein with Kazal motif，RECK)小鼠抗人抗體、Sp1小鼠抗人抗體和甘油醛-3-磷酸脫氫酶小鼠抗人抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz生物技術(shù)公司，質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自美國(guó)Romega公司。SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購(gòu)自碧云天科技公司。化學(xué)發(fā)光顯色液購(gòu)自美國(guó)Millipore公司。

1.2方法

1.2.1胃癌細(xì)胞培養(yǎng) 將胃癌細(xì)胞株SGC7901接種于含10%胎牛血清、鏈霉素100 μg/mL、青霉素100 U/mL、NaHCO31 g和谷胺酰胺0.3 g的RPMI1640培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2孵箱(日本SANYO公司 型號(hào)MCO-15AC)中培養(yǎng)；取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行傳代和處理。

1.2.2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的獲取 pSuNeo-Skp2表達(dá)質(zhì)粒由日本廣島大學(xué)Yasusei Kudo教授贈(zèng)予，正義鏈為：5′-tcgaGGGAGUGACAAAGACUUUGgaguacugCAAAGUC

UUUGUCACUCCCUUUUU-3′；反義鏈：5′-ctagAAAAAGGGAGUGACAAAGACUUUGcaguacucCAAAGUCUUUGUCACUCCC-3′；設(shè)計(jì)序列對(duì)應(yīng)114-133位核苷酸(GenBank NM_005983.2)。陰性無(wú)功能序列包含與上述陽(yáng)性質(zhì)粒相同的核苷酸，但為亂碼序列，且與其他種屬無(wú)同源性。……