核桃葉片總RNA提取方法的比較研究

賈建云等

摘要：通過對比Trizol、EASYspin和Qiagen 3種試劑盒提取方法，探討適合核桃葉片總RNA提取的有效方法。結果表明EASYspin試劑盒提取的RNA純度較高、完整性好，試驗用時較短，且試劑盒成本較低。

關鍵詞：核桃；總RNA；Trizol；EASYspin；Qiagen

中圖分類號：Q522文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2014）02-0011-03

核桃（Juglans regia L.）是我國重要的干果樹種，栽培歷史悠久，分布廣泛。目前，我國核桃的栽培面積和產量均居世界第一位[1]。RNA提取是分子生物學研究的基礎，也是試驗成敗的關鍵。關于植物RNA提取的方法很多，但由于不同植物材料細胞中次生代謝產物的種類、含量不同，適合的提取方法也不相同。核桃組織中富含多糖多酚等物質。酚類化合物在勻漿時極易被氧化成醌類物質， 與RNA 產生不可逆的結合， 從而影響RNA 的分離純化[2]。多糖的許多理化性質與RNA 相似，在提取過程中易與RNA 形成共沉淀[3]，且后期很難將其分離開，對RNA的分離和純化造成很大的干擾。若RNA提取方法不當，會導致RNA埋在多糖形成的粘稠膠狀物中難于溶解、分離，嚴重影響后續試驗的穩定性。隨著核桃研究的不斷深入，對核桃總RNA質量的要求也越來越高，因此，有必要篩選理想的提取方法。

本研究用Trizol、EASYspin和Qiagen 3種試劑盒提取核桃葉片總RNA，通過對RNA純度和完整性的比較，篩選最適合核桃葉片總RNA提取的方法，為今后核桃的分子生物學試驗奠定基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

本試驗所用材料采自國家果樹種質泰安核桃板栗資源圃，隨機從樹的不同方位挑取生長發育正常的幼葉，立即液氮速凍，于-70℃超低溫冰箱中保存備用。

1.2試劑與耗材

Trizol、EASYspin RN09與Qiagen 3種試劑盒分別購自北京全式金生物技術有限公司、北京艾德萊（Aidlab）生物科技有限公司和德國凱杰公司。試驗所用器皿用0.1% DEPC水處理24 h以上，然后高溫滅菌；研缽、玻璃器皿等在180℃高溫烘烤12 h以上，備用。

1.3試驗方法

提取方法均按相應試劑盒說明書進行。RNA溶解后，分別取2 μl樣品，1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統下觀察RNA條帶的完整性，并拍照記錄；另分別取1 μl樣品，用紫外分光光度計測定230、260、280 nm下的OD值，并計算OD260/OD280、OD260/OD230值及RNA產率。

2結果與分析

2.13種方法提取總RNA的完整性比較

Trizol試劑盒法提取核桃葉片未能得到肉眼可見的白色RNA沉淀，EASYspin試劑盒與Qiagen試劑盒均為離心柱型試劑盒，提取過程中無法判斷沉淀量。經瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果（圖1）顯示，Trizol試劑盒法沒有獲得RNA，只有少量降解物；EASYspin試劑盒法和Qiagen試劑盒法提取的核桃葉片總RNA均可見28S、18S和5S RNA譜帶，其條帶清晰、明亮、完整、無拖尾現象，說明提取的RNA濃度較高、獲得量較大且完整無降解。EASYspin試劑盒法點樣孔處比較干凈，說明提取過程中DNA和蛋白質等污染很少；Qiagen試劑盒法點樣孔處有少量殘留，表明有微量DNA或蛋白質等雜質的污染。綜合比較可知，EASYspin試劑盒法提取的RNA質量較高，效果較好。

3結論與討論

核桃葉片中富含多糖多酚等物質，酚類化合物被氧化后會與RNA不可逆的結合，導致RNA活性喪失或形成不溶性復合物；多糖會形成難溶的膠狀物，與RNA共沉淀[4～6]。因此，必須選擇去除多糖多酚的方法進行核桃RNA的提取。EASYspin試劑盒中的RNA助提劑PLANTaid能夠幫助結合多糖多酚，并通過離心去除，提高清除效果。本試驗結果顯示，Trizol試劑盒法未能提取到RNA，EASYspin與Qiagen試劑盒法提取過程基本相似，方便快捷，提取RNA的質量與產率相當，且用時較短，整個過程不到1 h，與CTAB等方法[7～10]相比大大縮短了試驗時間。此外，與進口的Qiagen試劑盒相比，國產的EASYspin試劑盒價格低廉很多。

因此，EASYspin試劑盒法最適合核桃葉片總RNA的提取，該法獲得的RNA完整性好，無降解，純度和產率較高，試驗耗時少，且試劑盒成本較低。本試驗結果為核桃cDNA文庫的構建、RT-PCR及其他分子生物學研究奠定了良好的基礎，也為其他植物材料的RNA提取提供參考。

參考文獻：

[1]郗榮庭， 張毅萍. 中國果樹志核桃卷[M].北京：中國林業出版社， 1996.

[2]Loomis W D. Overcoming problems of phenolics and quinines in the isolation of plant enzymes and organelles[J]. Meth. Enzymol.， 1974， 31： 528-544.

[3]Logemann J， Schell J， Willmitzer L. Improved method for the isolation of RNA from plant tissues[J]. Anal. Biochem.， 1987， 163（1）： 16-20.

[4]Schneiderbauer A， Sandermann H Jr， Ernst D. Isolation of functional RNA from plant tissues rich in phenolic compounds[J]. Anal. Biochem.， 1991， 197（1）： 91-95.

[5]Graham G C. A method for extraction of total RNA from Pinus radiata and other conifers[J]. Plant Mol. Biol. Repor.， 1993， 11（1）： 32-37.

[6]Lewinsohn E， Steele C L， Croteau R. Simple isolation of functional RNA from woody stems of gymnosperms [J]. Plant Mol. Biol. Repor.， 1994， 12（1）： 20-25.

[7]Zeng Y， Yang T. RNA isolation from highly viscous samples rich in polyphenols and polysaccharides [J]. Plant Mol. Biol. Repor.， 2002， 20（4）：417.

[8]劉曉菊，洪海波，李敏，等. 改良CTAB法提取核桃總RNA試驗[J]. 山東農業科學，2008， 1：97-99.

[9]李曉穎，曹雪，房經貴，等. 杏葉片與果實總RNA提取方法研究[J]. 中國農學通報，2010， 26（2）：152-156.

[10]Tinney G W， Pritchard S C， Gonzalez R， et al. Elimination of oxalate contamination in RNA isolation from Rumex obtusifolius[J]. Plant Mol. Biol. Repor.， 2002， 20（3）：309.

摘要：通過對比Trizol、EASYspin和Qiagen 3種試劑盒提取方法，探討適合核桃葉片總RNA提取的有效方法。結果表明EASYspin試劑盒提取的RNA純度較高、完整性好，試驗用時較短，且試劑盒成本較低。

關鍵詞：核桃；總RNA；Trizol；EASYspin；Qiagen

中圖分類號：Q522文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2014）02-0011-03

核桃（Juglans regia L.）是我國重要的干果樹種，栽培歷史悠久，分布廣泛。目前，我國核桃的栽培面積和產量均居世界第一位[1]。RNA提取是分子生物學研究的基礎，也是試驗成敗的關鍵。關于植物RNA提取的方法很多，但由于不同植物材料細胞中次生代謝產物的種類、含量不同，適合的提取方法也不相同。核桃組織中富含多糖多酚等物質。酚類化合物在勻漿時極易被氧化成醌類物質， 與RNA 產生不可逆的結合， 從而影響RNA 的分離純化[2]。多糖的許多理化性質與RNA 相似，在提取過程中易與RNA 形成共沉淀[3]，且后期很難將其分離開，對RNA的分離和純化造成很大的干擾。若RNA提取方法不當，會導致RNA埋在多糖形成的粘稠膠狀物中難于溶解、分離，嚴重影響后續試驗的穩定性。隨著核桃研究的不斷深入，對核桃總RNA質量的要求也越來越高，因此，有必要篩選理想的提取方法。

本研究用Trizol、EASYspin和Qiagen 3種試劑盒提取核桃葉片總RNA，通過對RNA純度和完整性的比較，篩選最適合核桃葉片總RNA提取的方法，為今后核桃的分子生物學試驗奠定基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

本試驗所用材料采自國家果樹種質泰安核桃板栗資源圃，隨機從樹的不同方位挑取生長發育正常的幼葉，立即液氮速凍，于-70℃超低溫冰箱中保存備用。

1.2試劑與耗材

Trizol、EASYspin RN09與Qiagen 3種試劑盒分別購自北京全式金生物技術有限公司、北京艾德萊（Aidlab）生物科技有限公司和德國凱杰公司。試驗所用器皿用0.1% DEPC水處理24 h以上，然后高溫滅菌；研缽、玻璃器皿等在180℃高溫烘烤12 h以上，備用。

1.3試驗方法

提取方法均按相應試劑盒說明書進行。RNA溶解后，分別取2 μl樣品，1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統下觀察RNA條帶的完整性，并拍照記錄；另分別取1 μl樣品，用紫外分光光度計測定230、260、280 nm下的OD值，并計算OD260/OD280、OD260/OD230值及RNA產率。

2結果與分析

2.13種方法提取總RNA的完整性比較

Trizol試劑盒法提取核桃葉片未能得到肉眼可見的白色RNA沉淀，EASYspin試劑盒與Qiagen試劑盒均為離心柱型試劑盒，提取過程中無法判斷沉淀量。經瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果（圖1）顯示，Trizol試劑盒法沒有獲得RNA，只有少量降解物；EASYspin試劑盒法和Qiagen試劑盒法提取的核桃葉片總RNA均可見28S、18S和5S RNA譜帶，其條帶清晰、明亮、完整、無拖尾現象，說明提取的RNA濃度較高、獲得量較大且完整無降解。EASYspin試劑盒法點樣孔處比較干凈，說明提取過程中DNA和蛋白質等污染很少；Qiagen試劑盒法點樣孔處有少量殘留，表明有微量DNA或蛋白質等雜質的污染。綜合比較可知，EASYspin試劑盒法提取的RNA質量較高，效果較好。

3結論與討論

核桃葉片中富含多糖多酚等物質，酚類化合物被氧化后會與RNA不可逆的結合，導致RNA活性喪失或形成不溶性復合物；多糖會形成難溶的膠狀物，與RNA共沉淀[4～6]。因此，必須選擇去除多糖多酚的方法進行核桃RNA的提取。EASYspin試劑盒中的RNA助提劑PLANTaid能夠幫助結合多糖多酚，并通過離心去除，提高清除效果。本試驗結果顯示，Trizol試劑盒法未能提取到RNA，EASYspin與Qiagen試劑盒法提取過程基本相似，方便快捷，提取RNA的質量與產率相當，且用時較短，整個過程不到1 h，與CTAB等方法[7～10]相比大大縮短了試驗時間。此外，與進口的Qiagen試劑盒相比，國產的EASYspin試劑盒價格低廉很多。

因此，EASYspin試劑盒法最適合核桃葉片總RNA的提取，該法獲得的RNA完整性好，無降解，純度和產率較高，試驗耗時少，且試劑盒成本較低。本試驗結果為核桃cDNA文庫的構建、RT-PCR及其他分子生物學研究奠定了良好的基礎，也為其他植物材料的RNA提取提供參考。

參考文獻：

[1]郗榮庭， 張毅萍. 中國果樹志核桃卷[M].北京：中國林業出版社， 1996.

[2]Loomis W D. Overcoming problems of phenolics and quinines in the isolation of plant enzymes and organelles[J]. Meth. Enzymol.， 1974， 31： 528-544.

[3]Logemann J， Schell J， Willmitzer L. Improved method for the isolation of RNA from plant tissues[J]. Anal. Biochem.， 1987， 163（1）： 16-20.

[4]Schneiderbauer A， Sandermann H Jr， Ernst D. Isolation of functional RNA from plant tissues rich in phenolic compounds[J]. Anal. Biochem.， 1991， 197（1）： 91-95.

[5]Graham G C. A method for extraction of total RNA from Pinus radiata and other conifers[J]. Plant Mol. Biol. Repor.， 1993， 11（1）： 32-37.

[6]Lewinsohn E， Steele C L， Croteau R. Simple isolation of functional RNA from woody stems of gymnosperms [J]. Plant Mol. Biol. Repor.， 1994， 12（1）： 20-25.

[7]Zeng Y， Yang T. RNA isolation from highly viscous samples rich in polyphenols and polysaccharides [J]. Plant Mol. Biol. Repor.， 2002， 20（4）：417.

[8]劉曉菊，洪海波，李敏，等. 改良CTAB法提取核桃總RNA試驗[J]. 山東農業科學，2008， 1：97-99.

[9]李曉穎，曹雪，房經貴，等. 杏葉片與果實總RNA提取方法研究[J]. 中國農學通報，2010， 26（2）：152-156.

[10]Tinney G W， Pritchard S C， Gonzalez R， et al. Elimination of oxalate contamination in RNA isolation from Rumex obtusifolius[J]. Plant Mol. Biol. Repor.， 2002， 20（3）：309.

摘要：通過對比Trizol、EASYspin和Qiagen 3種試劑盒提取方法，探討適合核桃葉片總RNA提取的有效方法。結果表明EASYspin試劑盒提取的RNA純度較高、完整性好，試驗用時較短，且試劑盒成本較低。

關鍵詞：核桃；總RNA；Trizol；EASYspin；Qiagen

中圖分類號：Q522文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2014）02-0011-03

核桃（Juglans regia L.）是我國重要的干果樹種，栽培歷史悠久，分布廣泛。目前，我國核桃的栽培面積和產量均居世界第一位[1]。RNA提取是分子生物學研究的基礎，也是試驗成敗的關鍵。關于植物RNA提取的方法很多，但由于不同植物材料細胞中次生代謝產物的種類、含量不同，適合的提取方法也不相同。核桃組織中富含多糖多酚等物質。酚類化合物在勻漿時極易被氧化成醌類物質， 與RNA 產生不可逆的結合， 從而影響RNA 的分離純化[2]。多糖的許多理化性質與RNA 相似，在提取過程中易與RNA 形成共沉淀[3]，且后期很難將其分離開，對RNA的分離和純化造成很大的干擾。若RNA提取方法不當，會導致RNA埋在多糖形成的粘稠膠狀物中難于溶解、分離，嚴重影響后續試驗的穩定性。隨著核桃研究的不斷深入，對核桃總RNA質量的要求也越來越高，因此，有必要篩選理想的提取方法。

本研究用Trizol、EASYspin和Qiagen 3種試劑盒提取核桃葉片總RNA，通過對RNA純度和完整性的比較，篩選最適合核桃葉片總RNA提取的方法，為今后核桃的分子生物學試驗奠定基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

本試驗所用材料采自國家果樹種質泰安核桃板栗資源圃，隨機從樹的不同方位挑取生長發育正常的幼葉，立即液氮速凍，于-70℃超低溫冰箱中保存備用。

1.2試劑與耗材

Trizol、EASYspin RN09與Qiagen 3種試劑盒分別購自北京全式金生物技術有限公司、北京艾德萊（Aidlab）生物科技有限公司和德國凱杰公司。試驗所用器皿用0.1% DEPC水處理24 h以上，然后高溫滅菌；研缽、玻璃器皿等在180℃高溫烘烤12 h以上，備用。

1.3試驗方法

提取方法均按相應試劑盒說明書進行。RNA溶解后，分別取2 μl樣品，1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統下觀察RNA條帶的完整性，并拍照記錄；另分別取1 μl樣品，用紫外分光光度計測定230、260、280 nm下的OD值，并計算OD260/OD280、OD260/OD230值及RNA產率。

2結果與分析

2.13種方法提取總RNA的完整性比較

Trizol試劑盒法提取核桃葉片未能得到肉眼可見的白色RNA沉淀，EASYspin試劑盒與Qiagen試劑盒均為離心柱型試劑盒，提取過程中無法判斷沉淀量。經瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果（圖1）顯示，Trizol試劑盒法沒有獲得RNA，只有少量降解物；EASYspin試劑盒法和Qiagen試劑盒法提取的核桃葉片總RNA均可見28S、18S和5S RNA譜帶，其條帶清晰、明亮、完整、無拖尾現象，說明提取的RNA濃度較高、獲得量較大且完整無降解。EASYspin試劑盒法點樣孔處比較干凈，說明提取過程中DNA和蛋白質等污染很少；Qiagen試劑盒法點樣孔處有少量殘留，表明有微量DNA或蛋白質等雜質的污染。綜合比較可知，EASYspin試劑盒法提取的RNA質量較高，效果較好。

3結論與討論

核桃葉片中富含多糖多酚等物質，酚類化合物被氧化后會與RNA不可逆的結合，導致RNA活性喪失或形成不溶性復合物；多糖會形成難溶的膠狀物，與RNA共沉淀[4～6]。因此，必須選擇去除多糖多酚的方法進行核桃RNA的提取。EASYspin試劑盒中的RNA助提劑PLANTaid能夠幫助結合多糖多酚，并通過離心去除，提高清除效果。本試驗結果顯示，Trizol試劑盒法未能提取到RNA，EASYspin與Qiagen試劑盒法提取過程基本相似，方便快捷，提取RNA的質量與產率相當，且用時較短，整個過程不到1 h，與CTAB等方法[7～10]相比大大縮短了試驗時間。此外，與進口的Qiagen試劑盒相比，國產的EASYspin試劑盒價格低廉很多。

因此，EASYspin試劑盒法最適合核桃葉片總RNA的提取，該法獲得的RNA完整性好，無降解，純度和產率較高，試驗耗時少，且試劑盒成本較低。本試驗結果為核桃cDNA文庫的構建、RT-PCR及其他分子生物學研究奠定了良好的基礎，也為其他植物材料的RNA提取提供參考。

參考文獻：

[1]郗榮庭， 張毅萍. 中國果樹志核桃卷[M].北京：中國林業出版社， 1996.

[2]Loomis W D. Overcoming problems of phenolics and quinines in the isolation of plant enzymes and organelles[J]. Meth. Enzymol.， 1974， 31： 528-544.

[3]Logemann J， Schell J， Willmitzer L. Improved method for the isolation of RNA from plant tissues[J]. Anal. Biochem.， 1987， 163（1）： 16-20.

[4]Schneiderbauer A， Sandermann H Jr， Ernst D. Isolation of functional RNA from plant tissues rich in phenolic compounds[J]. Anal. Biochem.， 1991， 197（1）： 91-95.

[5]Graham G C. A method for extraction of total RNA from Pinus radiata and other conifers[J]. Plant Mol. Biol. Repor.， 1993， 11（1）： 32-37.

[6]Lewinsohn E， Steele C L， Croteau R. Simple isolation of functional RNA from woody stems of gymnosperms [J]. Plant Mol. Biol. Repor.， 1994， 12（1）： 20-25.

[7]Zeng Y， Yang T. RNA isolation from highly viscous samples rich in polyphenols and polysaccharides [J]. Plant Mol. Biol. Repor.， 2002， 20（4）：417.

[8]劉曉菊，洪海波，李敏，等. 改良CTAB法提取核桃總RNA試驗[J]. 山東農業科學，2008， 1：97-99.

[9]李曉穎，曹雪，房經貴，等. 杏葉片與果實總RNA提取方法研究[J]. 中國農學通報，2010， 26（2）：152-156.

[10]Tinney G W， Pritchard S C， Gonzalez R， et al. Elimination of oxalate contamination in RNA isolation from Rumex obtusifolius[J]. Plant Mol. Biol. Repor.， 2002， 20（3）：309.