自噬相關基因Beclin1和MAP1LC3B在膽囊癌組織中的表達及其意義

申增強　王世明　王小峰

[摘要] 目的 檢測自噬基因Beclin1、MAP1LC3B在原發性膽囊癌組織中的表達情況，探討細胞自噬在膽囊癌發生中的作用及其臨床意義。 方法 采用免疫組織化學SP方法，檢測Beclin1、MAP1LC3B在膽囊癌組織中的表達情況，并以同期手術切除的膽囊炎性疾病組織為對照；統計Beclin1和MAP1LC3B的表達情況，并分析其與膽囊癌臨床病理特征之間的關系。 結果 膽囊癌組和慢性膽囊炎組Beclin1的陽性表達率分別為45.7%和78.3%，MAP1LC3B的陽性表達率分別為47.8%和71.7%，兩組差異有統計學意義（P<0.05）。Beclin1和MAP1LC3B在不同年齡、性別、癌組織分化程度患者中的表達水平差異無統計學意義（P>0.05），但與周圍臟器侵犯情況、病理TNM分期有關（P<0.05）。Beclin1和MAP1LC3B在膽囊癌組織中的表達水平呈正相關（r=0.538，P<0.01）。結論 膽囊癌組織中Beclin1和MAP1LC3B表達水平明顯低于膽囊炎性疾病組織；Beclin1和MAP1LC3B的表達水平與膽囊癌侵襲能力及TNM分期有關，且兩者表達呈正相關；提示Beclin1和MAP1LC3B是反映膽囊癌生物學行為的重要指標，兩者之間可能存在著某種共同通路。

[關鍵詞] Beclin1；MAP1LC3B；膽囊癌

[中圖分類號] R735.8 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2014）02（b）-0007-04

膽囊癌是膽道系統中最常見的惡性腫瘤，在消化系統惡性腫瘤中居第5位[1]。膽囊癌發病隱匿，惡性程度高，早期常無特殊臨床癥狀，大量臨床資料報道多患者在明確診斷時多已處于中、晚期，其中晚期患者5年生存率<5%[2]。膽囊癌的發病機制目前仍不明確。自噬作為Ⅱ型程序性細胞死亡，已證實與腫瘤的發生、進展及腫瘤血管的形成等有關。Beclin1作為自噬形成過程中的一種重要正性調控因子，通過提高細胞自噬，能抑制腫瘤生長，是候選的抑癌靶基因[3]。有研究表明，微管相關蛋白1輕鏈3B（MAP1LC3）家族基因（MAP1LC3A、MAP1LC3B、MAP1LC3C）是重要的自噬相關基因，其中MAP1LC3B 和MAP1LC3C 參與了乳腺癌細胞的自噬[4-5]。目前，有關Beclin1和MAP1LC3B 在膽囊癌中表達的研究較少。本文旨在檢測Beclin1和MAP1LC3B在膽囊癌中的表達情況，并探究其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2008年1月～2011年12月山西醫科大學第一附屬醫院普外科46例膽囊癌患者癌組織標本，取同期手術切除的46例慢性膽囊炎患者膽囊炎性組織作為對照。46例膽囊癌患者中，男20例，女26例，年齡43～80歲，平均65.5歲；46例膽囊炎患者中，男22例，女24例，年齡23～75歲，平均42.5歲。其中，腺癌40例，鱗癌6例；病理分級：低分化15例，中分化23例，高分化8例。患者術前均未接受任何放療、化療及生物、免疫治療。所取標本均經甲醛固定，石蠟包埋，切片后用免疫組織化學方法檢測。

1.2 試劑及方法

兔抗人Beclin1、MAP1LC3B單克隆抗體購于武漢三鷹生物技術有限公司，分別按1∶150及1∶200的比例稀釋后作一抗，二抗和DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物公司。按SP法說明，進行免疫組織化學檢測操作。采用陽性腫瘤標本作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3 結果判定標準

Beclin1與MAP1LC3B為淡黃色到棕褐色表達，顆粒狀或均質狀分布，Beclin1陽性表達見于細胞質和細胞膜；MAP1LC3B陽性表達見于細胞質。隨機選擇鏡下5個高倍視野觀察，計算1000個細胞，綜合陽性細胞比率和著色深度評估，陽性細胞百分比<5%為0分，5%～50%為1分，～75%為2分，>75%為3分；細胞無著色評0分，淡黃色評1分，棕黃色評2分，棕褐色評3分。結果取2項評分之積，0分表示陰性；1～9分表示陽性。

1.4 統計學方法

采用SPSS 17.0統計學軟件進行數據分析；計數資料的比較采用χ2檢驗或者Fisher確切概率法；相關性采用等級相關的Spearman檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫組織化學檢測結果

2.1.1 Beclin1表達情況 在膽囊癌組織及膽囊炎性組織中均有Beclin1表達，膽囊癌中Beclin1的陽性表達率（45.7%）顯著低于膽囊炎性組織（78.3%）（P<0.05）（圖1）。

圖1 膽囊癌及慢性膽囊炎組織Beclin1表達免疫組織化學檢測結果

A.慢性膽囊炎；B.低分化膽囊癌；C.中分化膽囊癌；D.高分化膽囊癌

2.1.2 MAP1LC3B表達情況 MAP1LC3B 在膽囊癌和膽囊炎性組織中均有表達，膽囊癌中MAP1LC3B的陽性表達率（47.8%）明顯低于膽囊炎性組織（71.7%）（P<0.05）（圖2）。

圖2 膽囊癌及慢性膽囊炎組織MAP1LC3B表達免疫組織化學檢測結果

A.慢性膽囊炎；B.低分化膽囊癌；C.中分化膽囊癌；D.高分化膽囊癌

2.2 Beclin1和MAP1LC3B表達情況與膽囊癌臨床病理特征的關系

Beclin1和MAP1LC3B在不同年齡、性別、癌組織分化程度患者中的表達水平差異無統計學意義（P>0.05），但與周圍臟器侵犯情況、TNM分期有關（P<0.05）（表1）。

表1 膽囊癌組織中Beclin1和MAP1LC3B的表達情況與臨床病理特征的關系（n）

2.3 Beclin1與MAP1LC3B 表達的相關性

Spearman 相關分析顯示，Beclin1與MAP1LC3B在膽囊癌組織中表達呈正相關（r=0.538，P<0.01）（表2）。

表2 Beclin1和MAP1LC3B在膽囊癌組織中表達的相關性（n）

3 討論

自噬介導的細胞死亡不同于凋亡（Ⅰ型程序性死亡），被稱為Ⅱ型程序性死亡。自噬過程在生物進化過程中高度保守，從低等生物酵母、果蠅到高等生物人均能找到自噬過程的同源基因。雙層膜結構包裹部分或整個細胞成分，形成自噬泡，然后與溶酶體結合，形成自噬溶酶體，導致被包裹的物質和自噬體內膜的降解。通過自噬過程，細胞實現氨基酸、核酸等生物分子的循環使用[7]，維持內環境穩態，清除衰老和無功能的細胞，抑制癌細胞過度增殖，清除病原微生物[8]。

自噬體的形成與自噬相關基因（ATG）有關[9]。自噬體的形成過程中有3個關鍵步驟：ULK1絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、ATG13和FIP200形成ULK1復合物；Beclin1與Ⅲ型PI3K形成復合體；微管相關蛋白輕鏈3（LC3）的脂化[10]。

Beclin1位于人染色體17q21上，大小約為150 kb，是酵母ATG6基因的同源物。Beclin1參與誘導自噬泡的行成。Beclin1與Ⅲ型PI3K形成復合體，能調控其他自噬蛋白在自噬前體中的結構定位[11]。研究發現，抗凋亡蛋白Bcl-2和Beclin1結合后，抑制Beclin1活性，降低自噬水平[12]。Liang等[13]發現與正常乳腺上皮結構中Beclin1蛋白高表達不同，乳腺癌組織中Beclin1表達顯著降低。此后諸多研究闡明，與正常組織對比，Beclin1在食管癌[14]、卵巢癌[15]、喉癌[16]等多種腫瘤組織中的表達均明顯降低，表明自噬對腫瘤的發生、發展有一定的抑制作用。

LC3是酵母ATG8基因的類似物，定位于自噬前體和自噬泡的膜表面。MAP1LC3B是編碼自噬相關蛋白的重要基因。在缺氧狀態下，MAP1LC3B和ATG5表達能調控轉錄子ATF4介導的腫瘤細胞轉移[17]。人MAP1LC3B并沒有發生羧基端的切割反應，而且羧基端的甘氨酸被賴氨酸代替，成為人MAP1LC3B發生修飾反應的活性位點。人LC3A的膜定位與Gly120位點的切割和修飾密切相關，進一步研究表明參與其修飾的分子也與其他基因不同，以上結果提示MAP1LC3B存在翻譯后修飾羧基端切割自噬作用[18-19]。

惡性腫瘤的轉移是一個多基因共同參與的多階段過程，Beclin1和MAP1LC3可能與其他調控自噬的基因共同作用，抑制腫瘤轉移。有研究表明PTEN可下調ClassⅠPI3K活性通路，可能使血管內皮細胞發生自噬性死亡，抑制新生血管形成，抑制腫瘤轉移。

綜上所述，Beclin1與MAP1LC3B在膽囊癌中表達水平降低，說明自噬活性的降低參與膽囊癌的發生、發展。在腫瘤中，自噬起著“雙刃劍”的作用，在低氧條件下，自噬可以通過能量物質的循環使用，避免細胞死亡；但自噬又是重要的細胞死亡途徑。而自噬在膽囊癌中的具體調控機制有待進一步研究。

[參考文獻]

[1] Kayahara M，Nagakawa T.Recent trends of gallbladder cancer in Japan：an analysis of 4770 patients[J].Cancer，2007，110（3）：572-580.

[2] Dutta U.Gallbladder cancer：can newer insights improve the outcome？[J].J Gastroenterol Hepatol，2012，27（4）：642-653.

[3] Liang XH，Jackson S，Seaman M，et al.Induction of autophagy and inhibition of tumorigenesis by beclin1[J].Nature，1999， 402（6762）：672-676.

[4] Sato K，Tsuchihara K，Fujii S，et al. Autophagy is activated in colorectal cancer cells and contributes to the tolerance to nutrient deprivation[J].Cancer Res，2007，67（20）：9677-9684.

[5] Din FV，Valanciute A，Houde VP，et al.Aspirin inhibits mTOR signaling， activates AMP-activated protein kinase， and induces autophagy in colorectal cancer cells [J].Gastroenterology，2012，142（7）：1504-1515.

[7] Kroemer G，Levine B. Autophagic cell death：the story of a misnomer[J].Nat Rev Mol Cell Biol，2008，9（12）：1004-1010.

[8] Oh SY，Choi SJ， Kim KH，et al.Autophagy-related proteins，LC3 and Beclin-1，in placentas from pregnancies complicated by preeclampsia[J]. Reprod Sci，2008，15（9）：912-920.

[9] Othman EQ，Kaur G，Mutee AF，et al. Immunohistochemical expression of MAP1LC3A and MAP1LC3B protein in breast carcinoma tissues[J].J Clin Lab Anal，2009，23（4）：249-258.