腸道病毒的PCR檢測方法評價與改進

王芳

常州市武進區疾病預防控制中心，江蘇常州 213164

腸道病毒的PCR檢測方法評價與改進

王芳

常州市武進區疾病預防控制中心，江蘇常州 213164

目的研究分析PCR檢測腸道病毒的方法評價及改進措施。方法擇取2013年8月—2014年8月期間在常州第一人民醫院接受檢測治療的50例心血管內科急性心肌梗塞患者作為觀察組，并抽取同期在該院體檢的20例健康者作為對照組。分別采集兩組研究對象的血清，均接受PCR方法檢測，病毒分離與鑒定，CoxB V中和抗體檢測，ELISA檢測，并且實施腸道病毒病原與抗體檢測，然后對比不同檢測方法的結果。結果 觀察組50例患者中，PCR檢測得出EV-RNA陽性者20例，檢出率為40%；病毒分離法分離出病毒4株，檢出率為8%。通過ELISA檢測得出的陽性者12例，陽性率為24%；CoxB V中和抗體檢測出陽性為10例，陽性率為20%，二者之間存在顯著性差異，P＜0.05有統計學意義。結論PCR檢測方法具有一定的優越性，其敏感度、特異性更高。

PCR檢測方法；M-PCR檢測方法；腸道病毒；改進措施

1985年，Cetus公司與加利福尼亞大學聯合創造了PCR技術[1]，其中主要的貢獻人員為Kary BmuliS與Henery AErlich。PCR技術自產生之后就被廣泛地應用于分子克隆、序列分析、傳染病及考古研究等很多領域中，所發揮的作用越來越大。正是由于PCR技術的突出作用于貢獻，KaryBmuliS在1993年獲得了諾貝爾化學獎。醫學界也開始漸漸關注并開始廣泛使用PCR檢測方法，通過引物的設計來完成對大類病毒的綜合檢測。雖然PCR技術有著獨有的特點與優勢，但是在對病毒檢測的過程中依舊存在著一些不足之處，需要不斷改進與優化。近20年來，PCR分子生物領域具有革命性的技術突破，已在生命科學研究領域中得到了廣泛應用。該研究對2013年8月—2014年8月在常州第一人民醫院接受檢測治療的50例心血管內科急性心肌梗塞患者進行研究介紹腸道病毒的幾種檢測方法，重點介紹了PCR檢測方式的原理、特點，對PCR檢測技術應用于腸道病毒的檢測進行了評價，通過4種腸道病毒檢測方式的對比試驗得出了相應的試驗結果，證明了之后指出了PCR檢測方法的發展，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

擇取常州第一人民醫院接受檢測治療的50例心血管內科急性心肌梗塞患者作為觀察組，其中26例男性患者，24例女性患者。年齡范圍36～85歲，平均年齡（61.02±6.63）歲。并抽取同期在該院體檢的20例健康者作為對照組，其中男性11例，女性9例。年齡范圍35～83歲，平均年齡（58.85±7.74）歲。兩組研究對象之間的一般資料差異無統計學意義（P＞0.05），試驗可比性突出。

1.2 方法

1.2.1 PCR檢測方法檢測腸道病毒核糖核酸 腸道病毒RNA提取—取血清的樣本100 μL，在血清中加入GITC變性液220 μL，加入氯放與異戍醇的按照49:1進行混合的液體50μL，加入pH值為4.0的NaAc30 μL，水飽和酚150 μL，將這些液體混合之后進行劇烈的振蕩，然后在-20℃的溫度直線冷卻10 min，之后再進行5 min（13000 r/min）的離心運動，取出其中200 μL的液體，在其中加入200 μL的異丙醇，之后將新得到的液體在-20℃的環境之下靜置1 h，再次進行10 min（13000 r/min）的離心運動，除去上部分的清液，將剩余部分利用乙醇進行洗滌沉淀之后自然揮發或者烘干之后放置備用[2]。

PCR方法檢測腸道病毒RNA——PCR的成分與比例為雙蒸水14.3 μL、10 X Buffer 2 μL、10 mmol MgCl23 μL,15 mmol dNTP 4μL,引物Q1 0.5 μL，Q2 0.5 μL，Taq酶0.3 μL，逆轉錄酶AMV 0.3 μL；42℃恒溫水浴逆轉錄30 min之后就能夠實現RNA的擴增。擴增的程序為95℃變性進行5 min，60℃復性30 s，70℃延伸90 s，實現35個循環之后在進行70℃的延伸5 min。將擴增的產物取出5 μL之后加入酚藍顯示劑，之后將混合物點樣在3%瓊脂糖凝膠省，經過30 min 100V的電泳之后在紫外線之下觀測結果[3]。

1.2.2 病毒分離與鑒定

利用常規的病毒分離與鑒定的方法對病人血清中的病毒進行分離，該種方法利用的是Hep-2細胞。當病人的血清出現細胞病變時，利用腸道病毒組合血清與Coxb V單價血清對其進行鑒定。這種病毒分離與鑒定的方法能夠對血清與CoxB V1-6型毒株進行診斷。

1.2.3 CoxB V中和抗體檢測 分步取患者在入院初與出院前采集的兩次血清，通過自身分離病毒或者CoxB V1-6型作為抗原進行檢測[4]。血清需要經過1:10稀釋，稀釋之后的血清要在55℃的環境之下進行30 min的滅活，之后經稀釋的比例增加到1:320，將再次稀釋后的血清與100 TCID50病毒進行等量的混合，將混合液置于35℃的環境之下進行1 h的結合，之后進行細胞接種，將細胞與病毒進行對照，終點為病毒被完全抑制、細胞病變終止。以陽性為標準進行判定，雙份的血清抗體滴度升高的幅度大于4倍，單份血清與正常人的血清抗體滴度的比例大于1:80。

1.2.4 ELISA檢測方法 取患者的血清樣本，將血清在56℃的環境下進行30 min的滅活，然后在血清中以此加入酶結合物與底物，之后振蕩1 min進行混合，將混合液進行倍比稀釋（1：2～1:4000），之后將稀釋液放置在96孔微量培養板中為生長液，每一個稀釋度放置4個復孔。在復孔中加入50 μL病毒液，混合均勻之后在溫度為37℃、還有2%二氧化碳的培養箱中進行培養。對培養箱中的情況觀測5 d，之后用Reed-Muench方法進行結果的計算[5]。

Reed-Muench法：觀察CPE,找出能引起半數細胞瓶或管感染的病毒稀釋倍數，按以下公式計算出該病毒液的TCID50。

logTCID50=高于50%的病毒稀釋度的對數＋距離比例×稀釋系數的對數距離比例=（高于50%的百分數-50%）/（高于50%的百分數-低于50%的百分數）。

1.3 統計方法

選用統計學軟件SPSS13.0對試驗數據實施系統化處理，運用χ2對試驗所得計數數據進行檢驗。當對比差異P＜0.05時，差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PCR檢測方法與病毒分離檢測方法

50例患者中通過PCR檢測方法檢測出EV-RNA陽性的為20例，檢出率為40%；病毒分離法分離出病毒4株，檢出率為8%，其中CoxB 1型為1株、4型為2株、埃可病毒15型為1株。在PCR檢測方法檢測的20例陽性中，分離病毒檢測出其中陰性的 12例，兩者共同檢測為陽性的4例，兩者共同檢測為陰性的為34例，總符合率為81.9%（見表1）。兩種方法對比之后差別非常顯著，差異χ2=8.748，P＜0.05，有統計學意義。對照組中的20例，病毒分離沒有分離出病毒，PCR檢測方法檢測出陽性1例，誤差率為2%。

表1 PCR檢測方法與病毒分離檢測方法檢測結果[n（%）]

2.2 ELISA檢測方法與中和CoxB V中和抗體檢測方法

50例患者中用ELISA方法檢測陽性為12例，陽性率為24%；CoxB V中和抗體檢測出陽性為10例，陽性率為20%；兩種方法檢測都為陽性的共10例。ELISA檢測為陽性的12例中，CoxB V中和抗體檢測方法檢測為陰性的共2例，兩種方法都為陰性的35例，總符合率為96.8%，兩種方面差異無統計學意義（χ2=0.149，P＞0.05）。見表2。

表2 ELISA檢測與中和CoxB V中和抗體檢測結果[n（%）]

3.4 對比結果

通過上述的實驗結果表明，PCR能夠更加快速、特異與可靠的進行診斷，在當天就能夠得到檢測結果。在50例患者中陽性20例（40%），而病毒分離僅僅4例（8%）。在病毒分離陽性的4例中，PCR陽性4例，此外的16例PCR陽性病例病毒分離全部為陰性，因此PCR的敏感度較高，差異有統計學意義（χ2=8.748，P＜0.05）。

3 討論

PCR是體外DNA或RNA擴增的方法，這種擴增具有選擇性[7]。通過對特定的微生物物種的特異性基因區域進行體外擴增，然后通過一定的DNA分析技術確定微生物的種類與含量。PCR反應主要包括三個階段：對目標DNA系列進行加熱變性；引物退火復性；在聚合酶作用之下DNA進行引物延伸。PCR檢測方法特異性高，能夠在較高的溫度之下進行連續反應；敏感度高能夠將微量的把DNA進行百萬倍以上的擴增，能夠滿足檢測分析所需要的DNA數量；反應速度快，PCR能夠在2 h內完成30次左右的循環擴增；可擴增RNA或cDNA，能夠利用寡脫氧胸昔引物和逆轉錄酶將mRNA轉變成單鏈cDNA,再將單鏈cDNA進行擴增，在mRNA很少的情況之下也能夠進行序列分析。通用引物PCR特點為使用一對引物對多個模板進行同時擴增，但擴增產物大小相同，難以區分。多重PCR采用多對引物對多個模板同時擴增，按照產物片段不同長度進行鑒別，但是引物多，結果會產生一定差異。該研究腸道病毒檢測中將二者結合，取長補短。

袁長青[7]等人研究發現，PCR檢測方法是利用腸道病毒的特異性引物檢測標本中和腸道病毒RNA同源的基因序列，將其作為判斷結果的依據。對DNA進行重復的擴增之后檢測方面的靈敏度能夠增加大10-5～10-6μg。該研究結果顯示，50例患者中通過PCR檢測方法檢測出EV-RNA陽性的為20例，檢出率為40%，這說明PCR檢測方法具有特異性高、敏感度高、速度較快，能夠更加快速、特異與可靠的進行診斷。

朱坤[8]等人指出，在腸道病毒的PCR檢測過程中也會出現一些問題。主要包含：假陽性問題，是指不應該出現陽性結果時出現了陽性結果；假陰性問題，是指在應該出現陽性結果的時候并沒有出現陽性結果。該研究結果顯示，在PCR檢測方法檢測的20例陽性中，分離病毒檢測出其中陰性的12例，兩者共同檢測為陽性的4例，兩者共同檢測為陰性的為34例，總符合率為81.9%。由此可見，PCR技術靈敏度、特異性等方面有了較大的發展，而且已經在分子生物學等學科中得到了廣泛的使用，有著不可比擬的優越性。雖然在某些方面依舊存在著一些局限性，但是隨著PCR技術與其他各項技術的不斷發展，將能夠彌補這些缺陷，成為生物技術發展領域的趨勢所在。

[1]張崇森，劉永軍，王曉昌.環境水體中腸道病毒的膜吸附一洗脫濃縮方法的研究[J].環境科學，2007，28(7):1543-1547.

[2]費選文，林祥偉，謝若男.應用4種方法檢測腸道病毒的結果分析[J].海峽預防醫學雜志，2009，9（1）:45-46.

[3]裘湛，聞岳，黃翔峰.PcR-DGGE技術在水解酸化缺氧法處理采油廢水的微生物研究中的應用[J].環境污染與防治，2006，28(6):439-442.

[4]吳小兵，董小巖，伍志堅.一種快速高效分離腺病毒伴隨病毒的方法[J].科學通報，2010，45(19):2071-2075.

[5]沈曉麗.點免疫結合試驗測定柯薩奇病毒B組抗體在臨床的應用[J].中華心血管雜志,2011,20(2):1129-1134.

[6]牛玉宏，楊英珍，虞勇.腸道病毒基因實時定量RT-cR方法的建立[J].復旦學報(醫學科學版),2001，28(6):542-544.

[7]袁長青,葉建鋒,李君文.改進的PCR技術快速檢測水中腸道病毒的研究[J].中國衛生檢驗雜志,2011,12(4):132-133.

[8]朱坤,高秀杰,鄧中平,等.腸道病毒71型實時熒光RT-PCR檢測方法的建立及臨床評價[J].熱帶醫學雜志,2010,16(5):414-415.

R440

A

1674-0742（2014）12（b）－0188-02

2014-09-15）

王芳（1976.5-），女，江蘇武進人，本科，主管檢驗師，研究方向：微生物檢驗。