自體骨髓干細胞移植治療終末期肝病56 例臨床觀察*

趙文靜 張淑芹 劉淑榮 葉東霞 劉 薇

吉林省肝膽病醫院科研室(吉林 長春，130062)

各種原因引起肝臟疾病進展到終末期，常累及廣泛的肝實質細胞，造成肝功能失代償，最終導致肝功能衰竭［1］。對終末期肝病的治療臨床上主要以保肝對癥及預防并發癥為主，但總體治療效果并不理想，其病死率很高。目前原位肝移植仍然是其最有效的治療手段，但其存在供肝缺乏，移植后的免疫排斥反應和高額的醫療費用等缺點，限制了其在臨床上的應用［2］。研究表明，骨髓干細胞是肝細胞重要的肝外來源，在肝損傷和肝細胞再生的過程中，骨髓干細胞在特定的環境下可分化為肝干細胞和肝細胞，參與肝臟結構和功能的修復和重建［4～8］。干細胞相關技術的發展為終末期肝病的治療帶來了新的希望。我院在完成大量基礎研究和動物實驗的基礎上于2010年5 月開展自體骨髓干細胞移植技術，現已采用此技術治療56 例終末期肝病患者，將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2010年5 月-2013年5 月間我院收治的終末期肝病患者56 例，男41 例，女15 例，年齡24～62 歲，其中46 例為乙型肝炎肝硬化，4 例為丙型肝炎肝硬化，4 例為酒精性肝硬化，2 例為原發性膽汁性肝硬化;肝硬化Child-Pugh 分級:A 級10例，B 級39 例，C 級7 例。診斷均符合2000年全國(西安)病毒性肝炎學術會議標準及肝功能衰竭診療指南和病毒性肝炎防治方案診斷標準。

排除標準:患者年齡＜18 歲或＞65 歲;孕婦或哺乳期婦女;不愿提供知情同意者;合并腹腔、肺部或其他系統嚴重感染患者;心、肺、腎等重要臟器功能不全/衰竭患者;伴有嚴重的惡性腫瘤或血液系統疾病患者;合并如肝性腦病、上消化道大出血、肝腎綜合征等嚴重并發癥未控制患者;合并Ⅲ期高血壓，伴心、肝、腎并發癥之一的患者;伴有HIV 重疊感染患者;有酗酒或吸毒史患者;治療前1 周內化驗PTA ＜35%或有嚴重出血傾向;血常規檢測:WBC ＜4.0 ×109/L，PLT ＜50 ×109/L;過敏體質等其他嚴重情況影響治療。本項目通過吉林省肝膽病醫院倫理委員會及新技術委員會審查批準，并在上級衛生主管部門備案，患者及家屬充分知情并簽署知情同意書。

1.2 術前準備 術前經治醫生認真分析病歷，科主任主持科室醫生進行術前討論，向患者或其家屬交代手術可能引發的危險性及并發癥，保證患者及其家屬完全知情，同時簽署《自體骨髓干細胞采集術知情同意書》和《干細胞移植知情同意書》。術前患者檢測血常規、尿常規、糞常規、肝功能、腎功能、凝血4 項，尿妊娠試驗和肝臟儲備功能，行心電圖、胸片、腹部B 超，CT 等檢查。骨髓采集前兩天患者皮下注射集落細胞刺激因子100μg/d，qd，術前1 天行碘過敏實驗。術前4 小時患者禁食禁水，雙側腹股溝常規備皮。

1.3 骨髓的采集和干細胞分離 骨髓采集穿刺點為兩側髂后上棘，局部麻醉，18 號骨穿刺針無菌操作采集骨髓200ml 左右，以2500U 枸櫞酸鈉抗凝。在萬級無菌室采用負收集法分離骨髓干細胞，骨髓干細胞試劑盒購自寧夏中聯達生物有限公司。嚴格按照說明書操作分離干細胞，臺盼蘭拒染法檢測細胞活性，等滲鹽水稀釋到5ml，即進行干細胞移植。

1.4 骨髓干細胞移植方法 患者局部麻醉，在X 光透視下，經股動脈插管至肝固有動脈，注射造影劑，首先觀察肝內血管情況及有無占位病變，將分離好的干細胞緩慢地注入肝內，注射后用10ml 生理鹽水沖管，干細胞移植術后按照肝動脈導管治療術后常規護理，穿刺點加壓包扎，繃帶固定。

1.5 主要觀察指標

1.5.1 肝臟儲備功能指標檢測 注射用吲哚菁綠(ICG) (遼寧丹東醫創藥業有限責任公司);DDG-3300K 分析儀(日本光電工業株式會社)。采用PDD法測定患者治療前及治療12 周肝臟儲備功能，包括ICG 血 漿 清 除 率 (ICGK)、ICG15min 滯 留 率(ICGR15)。

1.5.2 肝臟合成功能指標檢測 檢測患者治療前和治療1 周、4 周、8 周、12 周血清Alb、CHE、PT 等肝臟合成功能指標。

1.5.3 干細胞移植術后肝臟超聲檢查 觀察患者治療前和治療4 周后患者的腹水情況以及肝臟內是否有新生物或腫瘤樣異常病灶。

1.5.4 患者癥狀體征及不良反應情況觀察 觀察患者干細胞移植治療術前后患者癥狀和體征，主要包括食欲、體力、肝病面容、蜘蛛痣及不良反應，不良反應主要包括發熱、穿刺部位出血和滲出等。

2 結果

2.1 患者骨髓采集和干細胞分離情況 患者骨髓采集量為120～180ml，分離細胞數為5.8 ×107～9.6 ×108，細胞存活率為96%～98%;相差顯微鏡下觀察細胞形態為單一、較大圓形的單個核細胞(插頁圖1)。流式細胞儀檢測CD34+細胞占5.6%～9.8%。

2.2 患者干細胞移植后癥狀體征改善情況 自體骨髓干細胞移植術后1 周91.6% 的患者食欲改善，87.5%的患者體力明顯改善，移植術后兩周部分患者出現肝病面容好轉，術后4 周有4 例患者蜘蛛痣明顯減少。

2.3 患者自體骨髓干細胞移植治療前后肝臟儲備功能指標變化 56 例患者骨髓干細胞移植前及術后12周檢測肝臟儲備功能，ICGK 和ICGR15 治療后較治療前好轉，ICGK 由移植前的(0.0885 ±0.0533)/min 升高到(0.1438 ±0.0756)/min，治療前后比較差異有顯著性意義(P ＜0.05);ICGR15 由移植前的(32.01 ±19.56)%下降到(19.31 ±15.63)%，差異有顯著性意義(P ＜0.05)。

2.4 患者自體骨髓干細胞移植治療前后肝臟合成功能指標變化 自體骨髓干細胞移植術后1 周，Alb 無明顯變化，術后4 周開始升高，隨觀察時間延長逐漸升高，術后12 周達到最高值，與治療前比較差異有顯著性意義(P ＜0.05);CHE、PT 移植術后持續改善，12 周時較術前增加最明顯，差異有顯著性意義(P ＜0.05)。

表1 患者自體骨髓干細胞移植治療前后肝臟儲備功能指標變化（±s)

表1 患者自體骨髓干細胞移植治療前后肝臟儲備功能指標變化（±s)

與治療前比較，* P ＜0.05

2.5 患者自體骨髓干細胞移植治療前后腹部超聲檢查結果 術后4 周18 例并發腹水患者中，有61.1%(11/18)腹水消失，27.8% (5/18)腹水減輕但沒有消退，術后4 周和12 周所有患者影像學檢查，肝臟部位均未發現新生物或腫瘤樣異常病灶。

2.6 患者自體骨髓干細胞移植后不良反應情況 本研究干細胞移植成功率為100% (56/56)，術后患者無發熱、感染和白細胞下降等不良反應，穿刺部位無出血及滲出。

3 討論

研究表明干細胞既有自我復制和高度增殖能力，又有多向分化潛能。體外研究與動物研究發現，骨髓干細胞在細胞因子誘導下可分化為肝細胞［9，10］，同時在向肝細胞分化過程中釋放多種細胞因子，從而參與肝臟的修復。干細胞移植臨床試驗的研究結果從患者受損肝臟功能的恢復和肝臟再生兩方面證實了骨髓干細胞對肝臟的修復作用。馬代全等［11］觀察結果顯示骨髓干細胞植術后4 周，終末期肝病患者納差、乏力等癥狀明顯改善，77.50%患者停止輸注人血白蛋白及使用利尿劑，在隨訪時間內未再出現腹水，術后1～6 個月血清Alb 較術前上升;兩個月后患者總膽紅素(TBil)水平較術前下降，與國內學者潘興南的研究結果相似［12］。Terai 等［13］采用自體骨髓MSCs (多能干細胞)移植治療肝硬化患者，移植后24 周患者血清Alb 升高，Child-Pugh 評分顯著提高。

本研究采用自體骨髓干細胞移植治療56 例終末期肝病患者，采用的是患者自體骨髓源性干細胞，可一次性采集120～180ml 骨髓，體外可分離出大約5.8 ×107～9.6 ×108個單個核細胞，滿足肝臟干細胞移植要求。體外分離純化后干細胞經肝固有動脈植入患者肝內。從治療后隨訪結果看，多數患者食欲和體力改善明顯，納差、乏力等癥狀消失，腹水消退，大多數患者在短期內白蛋白升高，凝血功能改善，到移植后12 周，患者肝臟儲備功能較治療前好轉。研究結果表明自體骨髓干細胞移植治療終末期肝病，患者臨床癥狀改善出現得早，腹水消退快，有效改善肝性腦病;有效修復肝損傷、改善肝功能、凝血功能及肝臟儲備功能，提高患者的生存質量。自體骨髓干細胞移植治療終末期肝病患者安全可行，無不良反應。

我們的研究仍處在起步階段，尚有許多工作和技術難點需要解決，如干細胞的最佳移植途徑、移植數量、移植細胞的長遠功能，均是關鍵性問題。如何促進移植干細胞向肝細胞完全意義上的轉化、以便更有效地改善病變肝組織的結構和功能是今后研究的重中之重。

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