閃式提取辣椒渣黃酮及總酚的工藝研究

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(1.貴州大學化學與化工學院，貴州貴陽 550000;2.貴州省建材產品質量監督檢驗院，貴州貴陽 550002;3.貴州省冶金化工研究所，貴州貴陽 550002)

從植物中提取的天然黃酮及總酚類化合物安全無毒,且具有較強的自由基清除能力,能幫助人類防治衰老、癌癥、動脈粥樣硬化等疾病,現已獲得醫藥食品界越來越多的青睞[1]。

辣椒渣為干紅辣椒經色素和辣椒堿類物質提取后的殘余物,其中含有大量黃酮及總酚類化合物,具有較高的經濟價值,目前已有一些研究對辣椒渣中該類成分進行了分離提取,并驗證了其生理活性[2-5]。閃式提取是根據組織破碎原理設計而成的一種新型輔助提取技術[6],其高速轉動的刀頭可產生機械剪切力、渦流負壓及相當于超聲波1/60的振動力,能夠迅速實現植物組織的破碎和有效成分的溶出,具有短時高效、條件溫和及操作簡便等優點[7],現已廣泛地應用于天然有效成分的提取,如三七蘆頭皂苷、黃芪多糖、甘草葉黃酮及茶葉兒茶素等[8-12]。本實驗首次采用閃式提取技術從辣椒渣中提取黃酮及總酚類化合物,以正交實驗優化得出最佳工藝條件,并采用HPLC法對提取物進行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

辣椒渣 干紅辣椒以閃式提取技術提盡色素和辣椒堿類物質后的殘余物;石油醚、甲醇、乙醇、丙酮及乙酸乙酯 分析純，國藥集團化學試劑有限公司;槲皮素標品、咖啡酸標品 貴州迪大生物科技有限責任公司。

閃式提取控制器JHBE-20A 河南金鼐科技發展有限公司;旋轉蒸發儀RE-3000 上海亞榮生化儀器廠;722紫外可見分光光度計 上海佑科儀器儀表有限公司;高效液相色譜儀L3000 北京普源精電科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃酮及總酚的閃式提取工藝流程 辣椒渣→脫脂→干燥→過篩(40目)→按料液比1∶15加入有機溶劑→閃式提取→減壓回收溶劑→黃酮及總酚提取物

1.2.2 最佳提取工藝參數的確定 在單因素實驗中,依次改變閃提過程的提取溶劑、甲醇濃度、閃提轉速和閃提時間,以黃酮及總酚的得率作為考察指標進行分析研究。并選取甲醇濃度,閃提轉速和閃提時間三個因素為研究對象。采用L9(34)正交實驗,以綜合評分法優化辣椒殘渣中黃酮及總酚的提取工藝條件。實驗設計見表1。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Factors and Levels of orthogonal experiment

1.2.3 黃酮及總酚得率的測定 采用分光光度法測定目標物質含量,其中黃酮得率:以蘆丁當量(Rutin Equivalent,RE/g)表示,采用AlCl3-HAC-NaAC比色法測定[13-14];總酚得率:以沒食子酸當量(Gallic Acid Equivalent,GAE/g)表示,采用Folin-Cioealteu比色法測定[15]。

1.2.4 辣椒渣甲醇提取物的HPLC分析 以甲醇為溶劑在閃提轉速4400r/min,閃提時間150s下對辣椒渣進行提取,得到的提取物按0.002g/mL的比例稀釋于甲醇中,過0.45μm的微孔,4℃下冷藏備用。色譜條件:Agilent TC-C18(250mm×4.6mm,5μm);流動相A-乙腈,流動相B-0.1%磷酸水溶液;流速1.0mL/min;梯度洗脫條件:0～20min,流動相A 10%～15%,20～30min,流動相A 15%～25%,30～42min,流動相A 25%～40%,42～45min,流動相A 40%～10%;檢測波長327nm;進樣量20μL;柱溫30℃。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果與分析

2.1.1 提取溶劑對黃酮及總酚得率的影響 閃提過程中控制閃提轉速3300r/min,閃提時間180s,設置不同的提取溶劑。提取溶劑對黃酮及總酚的得率影響見表2。由表2知,黃酮及總酚的得率均隨提取溶劑的極性增大而增大,當以甲醇為溶劑時,二者得率均達到最大值,說明辣椒渣中黃酮及總酚類物質的極性較大。因此,本實驗條件下,最適宜的提取溶劑為甲醇。

表2 不同溶劑對黃酮及總酚得率的影響Table 2 Influence of solvents on extraction yield of flavonoid and total phenol

2.1.2 甲醇濃度對黃酮及總酚得率的影響 閃提過程中控制閃提轉速3300r/min,閃提時間180s,設置不同濃度的甲醇溶液為提取溶劑。不同甲醇濃度對黃酮及總酚的得率影響見圖1。由圖1知,黃酮及總酚的得率隨甲醇濃度升高都呈先增大后減小的趨勢,當甲醇濃度為60%時二者得率均達到最大值。辣椒主要含黃酮醇、槲皮素等黃酮和咖啡酸、綠原酸等多酚[16],它們屬于極性物質。當甲醇濃度較低時,溶液極性較大,易溶解辣椒渣中糖苷類物質,對黃酮及總酚的溶解度不高。逐步提高甲醇濃度能使溶液極性與目標產物的極性接近,有利于其溶解,但在濃度過高的甲醇溶液中,一些色素類雜質會與其競爭同甲醇-水分子的結合,降低黃酮及總酚的得率。因此,本實驗條件下,最適宜的甲醇濃度為60%。

圖1 甲醇濃度對黃酮及總酚得率的影響 Fig.1 Influence of methanol concentration on extraction yield of flavonoid and total phenol

2.1.3 閃提轉速對黃酮及總酚得率的影響 閃提過程中控制甲醇濃度60%,閃提時間180s,設置不同的閃提轉速。不同閃提轉速對黃酮及總酚的得率影響見圖2。由圖2知,隨著閃提轉速的增加,黃酮及總酚得率都先增大后減小。其他條件不變,適當提高閃提轉速,可促進有效成分的溶出與擴散。當閃提轉速達到3300r/min后,再繼續提高閃提轉速,黃酮及總酚的得率卻逐漸減小,可能的原因為:在過高的閃提轉速下,刀頭劇烈攪拌粉碎,使辣椒渣中有效成分的粒徑減小,一方面會引起表面能的增大而被吸附在固體表面不易溶解;另一方面細微粒子會互相粘結,無法分離,兩方面原因都會導致黃酮及總酚的得率降低。因此,本實驗條件下,最適宜的閃提轉速為3300r/min。

圖2 閃提轉速對黃酮及總酚得率的影響 Fig.2 Influence of rotation on extraction yield of flavonoid and total phenol

表3 正交實驗結果Table 3 Result of orthogonal test

2.1.4 閃提時間對黃酮及總酚得率的影響 閃提過程中控制甲醇濃度60%,閃提轉速3300r/min,設置不同的閃提時間。不同閃提時間對黃酮及總酚的得率影響見圖3。由圖3知,黃酮及總酚的得率隨閃提時間的延長先增大后緩慢減小。其他條件不變,延長閃提時間有利于目標產物的充分溶出,提高得率。但提取時間過長會造成刀頭高速轉動的熱量囤積,體系溫度升高,一方面會引起溶劑揮發,傳質濃度梯度減小;另一方面會破壞一部分熱敏性的有效成分。因此,本實驗條件下,最適宜的閃提時間為180s。

圖3 閃提時間對黃酮及總酚得率的影響 Fig.3 Influence of extraction time on extraction yield of flavonoids and total phenol

2.2 閃式提取辣椒渣黃酮及總酚的正交實驗

2.2.1 正交實驗結果 以黃酮及總酚得率的綜合評分值y作為考察指標,設定黃酮及總酚的權重系數均為0.5,則各號實驗的綜合評分值y=(100x1/3.09)×0.5+(100x2/9.66)×0.5[17]。正交實驗結果見表3,實驗結果方差分析見表4。

表4 正交實驗方差分析表Table 4 Variance analysis chart of orthogonal test

注:F0.10(2,2)=9;F0.05(2,2)=19。當F>F0.05時,因素影響極顯著(表示為**);當F>F0.10時,因素影響顯著(表示為*);當F0.10>F時,因素影響不顯著。

由表4知,閃提轉速對辣椒渣中黃酮及總酚的得率影響極為顯著,甲醇濃度對得率影響顯著,閃提時間對得率影響不顯著,各因素對得率影響的主次順序為:閃提轉速>甲醇濃度>閃提時間。取各因素最高水平組合,得到辣椒渣中黃酮及總酚的最佳閃式提取工藝組合為A1B3C2,即最佳工藝條件為:甲醇濃度50%,閃提轉速4400r/min,閃提時間150s。

2.2.2 驗證實驗 正交實驗得到的最佳提取工藝為A1B3C2,正交表中沒有此組合,故補做驗證實驗,取等量原料,進行三次平行實驗,得到黃酮及總酚的得率分別為(3.07±0.05)mgRE/g和(9.61±0.12)mgGAE/g。

2.3 HPLC分析結果

采用HPLC法分別對咖啡酸和槲皮素的混合物對照品及辣椒渣甲醇提取物進行分析,結果如圖4:

圖4 對照品及辣椒渣甲醇提取物的HPLC色譜圖 Fig.4 HPLC chromatogram of standard and methanol extracts of capsicum residual

3 結論

閃式提取辣椒渣中黃酮及總酚的最佳工藝條件為:50%甲醇溶液、閃提轉速4400r/min及閃提時間150s,在此最佳工藝條件下,黃酮及總酚的得率分別為(3.07±0.05)mgRE/g和(9.61±0.12)mgGAE/g。采用HPLC法對提取物進行分析,鑒定出其中含槲皮素和咖啡酸。

本實驗采用閃式提取技術從經色素和辣椒堿類物質深加工后的辣椒渣中提取高附加值的黃酮及總酚,提取過程成本低、能耗低且短時高效、簡便易行,有利于促進整個辣椒深加工過程的環保化和資源高效化利用,實現辣椒原料的綜合開發利用。

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