乙醇-硫酸銨雙水相體系提取檸檬渣中 檸檬苦素研究

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(1.內江師范學院 化學化工學院，四川內江 641112;2.四川省高等學?！肮悘U棄物資源化”重點實驗室,四川內江 641112)

檸檬是一種營養豐富的柑橘屬植物,廣泛用于餐飲、烹調、美容、醫藥、輕紡、香精香料、食品加工、釀造、航空航天等行業[1-2]。中國是檸檬的主要產地之一,2011年全國檸檬產量達到30萬噸以上[3]。巨大的檸檬產量促進了檸檬生產加工產業的蓬勃發展,但也產生了大量的檸檬渣等廢棄物,不僅浪費了資源,也對環境帶來了巨大的壓力。檸檬苦素是檸檬渣中的一種重要的有效成分,該化合物具有鎮痛抗炎、抗氧化、抗癌、抑制HIV和抑制真菌、防蟲殺蟲等活性[4-8]。將檸檬渣中提取的檸檬苦素應用于食品、藥用等領域,既可實現其經濟價值,又符合新時代環保的綠色化理念。

目前從天然產物中提取有效成分的方法主要有:水提取法[9-10]、有機溶劑提取法[10-12]、酶輔助提取法[13]、超聲波輔助萃取法[11,14-15]、微波輔助萃取法[11,16]、超臨界流體萃取法[17]等。水提取法操作簡便,污染小,但提取效率較低;普通的有機溶劑提取法操作簡便,但提取時間較長,有時還用到有毒試劑,污染環境和產品;酶輔助提取法條件溫和,提取效率較高,但影響因素較多,酶容易失活;超聲波輔助萃取法操作簡便,條件溫和,時間短,成本低,得率較高,但超聲波對人體有較大危害,低劑量的超聲波是潛在的致癌和致畸形因素;微波輔助萃取法操作簡便,耗時短,消耗溶劑少,萃取效率較高,但微波對人的危害較大;超臨界流體萃取法萃取效率高,能耗較少,溶劑消耗較少,但設備復雜,提取成本高。雙水相萃取法條件溫和,操作簡便,提取效率較高,且幾乎不使用有毒溶劑,還避免了超聲波、微波對人體帶來的傷害,是一種新型的綠色環保的液-液萃取技術,很有發展前途[18]。本文以乙醇水溶液和硫酸銨按照一定比例組成的雙水相體系提取檸檬渣中的檸檬苦素,并通過單因素實驗和正交實驗考察了乙醇濃度、硫酸銨用量、料液比、提取溫度、提取時間對檸檬苦素得率的影響,確定用此雙水相體系提取檸檬渣中檸檬苦素的最佳工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

檸檬苦素標準品 優級純;乙醇、對二甲氨基苯甲醛、硫酸、三氯化鐵、硫酸銨 均為分析純;檸檬 四川安岳。

HK-04A型手提式高速粉碎機 廣州旭朗機械設備有限責任公司;DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責任公司;SHB-B95型循環水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司;T-6新世紀型紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;BT-323S電子分析天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 顯色劑的配制 顯色劑A:按照資料所述[19],準確稱取125mg 對二甲氨基苯甲醛于100mL硫酸乙醇(V硫酸∶V乙醇=65∶35)混合液中溶解,放置備用。顯色劑B:準確稱取三氯化鐵9.0g,用蒸餾水溶解并定容至100mL,放置備用。使用時往100mL顯色劑A中加入0.05mL顯色劑B,混勻。

1.2.2 檸檬苦素的提取與測定 標準溶液的配制:準確稱取10.00mg檸檬苦素標準品于50mL容量瓶中,加入無水乙醇,待溶解后,定容,得標準溶液,濃度為0.20mg/mL。

測定波長的選擇:準確量取1.00mL檸檬苦素標準溶液于10mL比色管中,加入5.00mL顯色劑混合溶液,搖勻,用無水乙醇定容,搖勻,顯色30min后,在300～600nm之間進行掃描,發現在500nm處出現強吸收峰,因此選擇500nm作為測定波長。

標準曲線的繪制:分別精確量取檸檬苦素標準溶液0.50、1.00、1.50、2.00、2.50mL于5支帶刻度試管中,用無水乙醇稀釋至10mL,分別加入5.00mL顯色劑,搖勻,顯色30min,在500nm處測定其吸光度。以吸光度為縱坐標,濃度為橫坐標,繪制標準曲線,求出直線回歸方程。

檸檬苦素的提取與測定:取檸檬渣粉末3.0000g于250mL圓底燒瓶中,按照設定的固液比加入一定濃度的乙醇溶液和一定量的硫酸銨,在一定溫度下,提取一定時間,抽濾,用分液漏斗將兩相分開,取上層清液,減壓濃縮,用無水乙醇溶解,轉移至25mL容量瓶中,定容。

準確移取提取液0.50mL于25mL比色管中,用無水乙醇稀釋至15mL,加入5mL顯色劑混合溶液,顯色30min后,在500nm波長處測定吸光度。根據標準曲線回歸方程,得到提取液濃度。檸檬苦素得率按照下式計算:

Et(%)=(C×V×n)/W×100

式中,Et為得率(%),C為測得的提取液濃度(g/mL),V為提取液體積(mL),n為稀釋倍數,W為原料的質量(g)。

1.2.3 乙醇濃度對提取效果的影響 在溫度為40℃,硫酸銨用量9g,乙醇用量30mL,提取時間1h的條件下,研究了乙醇體積濃度(20%、30%、40%、50%)對檸檬苦素提取效果的影響。

1.2.4 正交實驗 檸檬苦素的得率除受到乙醇濃度的影響外,還受制于很多其他因素。參考文獻方法[18],在乙醇體積濃度30%恒定的情況下,以提取溫度、時間、料液比(m檸檬:V乙醇)、硫酸銨用量為考察因素,每個因素選取4個水平,使用L16(44)正交表來安排實驗,每組實驗條件做了3次平行實驗。

2 結果與討論

2.1 標準曲線

檸檬苦素標準曲線如1所示:

從圖1可知,其檸檬苦素標準曲線的線性回歸方程為A=7.20C-0.0025,R2=0.9962。

圖1 檸檬苦素標準曲線 Fig.1 The standard curve of limonin

2.2 乙醇濃度對提取效果的影響

可供選擇的雙水相體系較多,本實驗選擇乙醇-硫酸銨雙水相體系,所用試劑無毒,條件溫和,其中乙醇濃度是提取效果的一個重要影響因素[18],如圖2所示。

圖2 乙醇體積濃度對檸檬苦素得率的影響 Fig.2 Effect of the ethanol concentration on the extraction of the limonin

從圖2可知,在硫酸銨用量一定的情況下,隨著乙醇濃度增加,檸檬苦素得率逐漸增加,當乙醇體積濃度達到30%時,達到最大,此后乙醇濃度繼續增大,檸檬苦素得率沒有明顯變化。其主要原因可能是,檸檬苦素在乙醇中的溶解度比水中大得多,隨著乙醇濃度增加,雙水相體系分相能力增加,乙醇在上層的濃度也逐漸增加,檸檬苦素的溶解度增加,當乙醇體積濃度達到30%時,檸檬苦素的浸出率趨于飽和,繼續增加乙醇濃度不會給檸檬苦素得率帶來明顯的變化。從節約資源的角度考慮,確定最佳的乙醇體積濃度為30%。

2.3 正交實驗結果分析

正交實驗設計、實驗結果及極差分析結果見表1。

表1 L16(44)正交實驗設計及結果Table 1 L16(44)orthogonal experimental design and results

由表1極差R值可知,影響檸檬渣中檸檬苦素得率的因素主次次序為:B>A>C>D,即料液比>硫酸銨用量>提取溫度>提取時間。

從對正交實驗結果直觀分析的角度看,條件A1B3C3D3時,檸檬苦素得率最高;但根據表1極差分析可知,檸檬渣中提取檸檬苦素的最佳工藝條件應為A1B4C3D1,即硫酸銨用量9g,檸檬渣和乙醇的料液比1∶25,提取溫度60℃,提取時間1h。由于此最佳組合不在正交實驗表中,為驗證此條件,對此組合再做了3個驗證性平行實驗,檸檬苦素的得率分別為0.276%,0.278%,0.283%,平均值0.279%,高于A1B3C3D3時的得率,即正交實驗中的最大值,表明A1B4C3D1確實為檸檬渣中提取檸檬苦素的最優工藝參數組合。

3 結論

本文通過設計單因素實驗和正交實驗,得出了乙醇-硫酸銨雙水相體系中影響檸檬苦素得率指標的因素大小順序為:料液比>硫酸銨用量>提取溫度>提取時間;提取檸檬渣中檸檬苦素的最佳工藝條件為:乙醇體積濃度30%,硫酸銨用量9g,檸檬渣和乙醇的料液比1∶25,提取溫度60℃,提取時間1h。進而通過實驗在最佳工藝條件下提取檸檬渣中檸檬苦素,不但得率較高,而且實驗重現性好,說明正交實驗得出的結論是正確的。該研究結果對于天然產物中有效成分的提取研究具有一定的參考價值。

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