大孔樹脂對酶解大豆肽脫鹽效果影響及其最佳條件研究

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(1.東北農業大學食品學院,黑龍江哈爾濱 150030;2.北大荒豆制品有限公司,黑龍江哈爾濱 150060)

透析、超濾、納濾為目前主要的脫鹽方法,但這些方法對小分子脫鹽效果不佳,而且肽回收率較低[5]。已有報道關于大孔樹脂對魚降壓肽有很好的脫鹽效果[6]。潘道東等研究了DA201-C對ACE抑制肽的靜態吸附實驗[7]。大孔樹脂利用的是吸附原理和分子篩原理,它主要通過范德華力、氫鍵的分子間作用力對分子進行吸附。在合適的環境下,吸附劑的內表面積愈大,吸附量愈高。鄧勁光,程云輝分別研究了不同種類的大孔樹脂對氫化可的松,麥胚肽的吸附洗脫性能[8-9]。基于樹脂孔徑的大小、極性的強弱和已有的研究綜合考慮,選擇5種不同樹脂對大豆肽進行靜態吸附解吸實驗,在確定吸附性能較好樹脂基礎上,優化出樹脂的最佳脫鹽條件,并對大豆肽進行初步的分離和純化。

表1 大孔樹脂的物理結構參數Table 1 Physics configuration parameters of the macroporous resin

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

DA201-C、AB-8、D3520、D4006和NAX-Ⅱ大孔吸附樹脂 鄭州勤實科技有限公司;大豆分離蛋白(蛋白含量89.12%) 谷神生物科技集團有限公司;Alcalase堿性蛋白酶諾維信(中國)生物技術有限公司;Folin-酚試劑 美國Sigma 公司;其他試劑均為分析純。

離心機 北京醫用離心機廠;LGJ 21真空冷凍干燥機 上海醫用分析儀器廠;pH計 奧多利斯科學(北京)有限公司;UV-2401PC紫外可見分光光度計 島津公司;1.5×60cm的層析柱 上海華美實驗儀器廠;HZQ-X100震蕩培養箱 哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大豆分離蛋白酶解液的制備 稱取一定質量的大豆分離蛋白于酶反應器中,加水調成一定的底物濃度(蛋白/水,w/w),磁力攪拌器勻速攪拌,待原料充分溶解后,反應溫度為55℃,pH控制在(8.0±0.10)。加入一定量的堿性蛋白酶,酶解時間為2h。當反應結束時,pH調為4.5使未水解的大分子蛋白沉淀,90℃滅酶10min,6000r/min離心10min,即得到粗酶解液,濃縮,冷凍干燥得到大豆肽。用pH-State法[10]控制酶解液的水解度,此水解度為15.6%。

1.2.2 大孔吸附樹脂靜態吸附實驗

1.2.2.1 大孔吸附樹脂的預處理 本實驗選用5種大孔吸附樹脂,樹脂的具體參考性能見表1。大孔吸附樹脂首先用無水乙醇浸泡24h,使樹脂充分溶脹,然后洗至220nm處無吸收峰,再用去離子水洗凈至無乙醇味,抽濾備用[11]。

1.2.2.2 大孔樹脂條件的優化 于250mL錐形瓶中加入經過預處理后的2.5g不同種類的樹脂,分別向其中濃度為25mg/mL的酶解液50mL,在搖床上震蕩12h,使其充分吸附,用不同稀釋度25%、50%、75%、100%的乙醇溶液對樹脂進行靜態解析,并測定溶液中肽的濃度及測定其脫鹽效果。脫鹽效果的測定用的是鉻酸鉀指示劑法測定肽液中Cl-濃度[12]。

1.2.2.3 DA201-C樹脂靜態吸附與解析實驗條件優化

a.pH對DA201-C樹脂吸附性能的影響:向5個250mL的錐形瓶中加入預處理好的2.5g的樹脂,乙醇充分溶脹之后,用去離子水洗凈乙醇,抽濾后備用。取5份濃度為15mg/mL的酶解液30mL,將pH分別調為4、5、6、7、8加入到錐形瓶中,置于25℃恒溫震蕩箱中,震蕩12h。吸附后多肽含量用Foline-酚法測定[13]。

b.酶解物濃度對DA201-C樹脂吸附性能的影響:向3個錐形瓶中加入預處理好的2.5g的樹脂,乙醇充分溶脹之后,用去離子水洗凈乙醇,抽濾后備用。向其中分別加入濃度為15、30、45、60mg/mL的酶解液20mL(pH均為4.5)。置于25℃恒溫震蕩箱中,震蕩12h。多肽含量測定方法如上。

c.不同乙醇濃度對解吸特性的影響:向5個錐形瓶中加入預處理好的2.5g的樹脂,乙醇充分溶脹之后,用去離子水洗凈乙醇,抽濾后備用。加入底物濃度為60mg/mL酶解液20mL,pH4.5,置于25℃恒溫震蕩箱中,震蕩12h。向其中分別加入濃度為0、25%、50%、75%和100%的無水乙醇溶液進行解吸。多肽含量測定方法如上。

解析率(%)=解析液多肽濃度×解析液體積/吸附量×樹脂質量×100

d.DA201-C樹脂對酶解液的動態解析特性研究:把預處理好的大孔吸附樹脂裝滿1.5cm×60cm的層析柱,室溫條件下,以1.5mL/min流速的酶解液經過層析柱,酶解液濃度為60mg/mL。用紫外檢測器于220nm處測定吸光值,以A220nm=0.05為透過點,先用去離子水以同樣的流速流經層析柱,每5min收集一管水洗脫液,當水洗脫液于去離子水的電導率相當時,用75%的乙醇對DA201-C樹脂以同樣的流速進行洗脫,每5min收集一管水洗脫液,并不斷用紫外分光光度計進行監測。測定脫鹽率及肽回收率。

1.3 數理統計

本實驗數據采用Excel進行方差分析及多重比較。

2 結果與分析

2.1 五種不同大孔樹脂的初步篩選

由圖1,可以得出所對應的5種大孔樹脂的吸附率分別為25.4%、32.33%、50.7%、35.97%、28.93%。經F檢驗p<0.05,各樹脂間吸附率存在差異,接著進行了多重比較,得出各樹脂之間差異顯著,其中DA201-C的吸附率較其它樹脂好,原因可能是該樹脂屬于非極性樹脂,比表面積較大,當濃度一定時,比表面積越大,單位時間內吸附蛋白的量越大。堿性蛋白酶酶解物具有較多的疏水性氨基酸,疏水基團與非極性吸附劑間形成范德華力、氫鍵[14],起到了很好的吸附效果。

圖1 5種大孔樹脂的吸附率 Fig. 1 Adsorption rate of five macroporous resins

由圖2結果可見當乙醇濃度為75%時,該列字母不同者為差異性顯著。DA201-C樹脂解析效果最好,且顯著高于其他各組(p<0.05)。由于不同濃度的乙醇具有不同的極性,其吸附解析過程對蛋白具有不同的選擇性。其實質是一種疏水性質的置換過程,乙醇能消弱蛋白質非極性側鏈的排水傾向,從而使肽洗脫下來[15]。當乙醇濃度為100%時,酶解物的解吸率下降可能是由于相對分子質量較大的肽類在無水乙醇中溶解度較低導致的。

圖2 5種大孔樹脂的靜態解析曲線 Fig. 2 Static adsorption curves of five macroporous resins to soybean peptides

不同樹脂脫鹽率見圖3,由圖可知,5種樹脂平均值均在85%以上,其中DA201-C的脫鹽率為92.9%,各樹脂間脫鹽率差異不顯著(p>0.05),均具有較好的脫鹽率,說明大孔樹脂對于鹽溶液不具有吸附性,在活性肽脫鹽方面起到很好的效果。

圖3 不同樹脂的脫鹽率 Fig. 3 Desalination rates of different macroporous resins

根據不同樹脂的靜態吸附得出DA201-C大孔吸附樹脂對大豆肽具有較好的吸附和解析性。本實驗對DA201-C大孔吸附樹脂靜態吸附解析特性進行研究,并測其動態吸附解析實驗。

2.2 DA201-C大孔吸附樹脂對大豆肽的靜態吸附與解析

2.2.1 pH對DA201-C吸附性能的影響 由圖4看出,pH在4～6之間吸附量之間不存在顯著差異,在酶解過程中需要把pH調為4.5沉淀大分子,直接用酶解液進行脫鹽處理即可。此結論與張曉梅[16]在大豆活性肽的研究中報道相一致。當pH為8.0時,吸附量有所增加,可能是酶解物為兩性的多肽混合物,其離子化程度的不同而使其發生變化。

圖4 不同pH條件下的吸附量 Fig. 4 Effect of different pH on adsorption capacity

2.2.2 不同酶解物濃度對吸附性能的影響 由圖5我們可以看出,隨著底物濃度的增加,大孔樹脂對大豆肽的吸附量增加,大豆肽的底物濃度為60mg/mL時,樹脂具有很好的吸附特性。在樹脂吸附的同時也伴隨著肽含量的損失,為了減少肽含量的損失,綜合考慮,本實驗選則濃度為60mg/mL的大豆肽進行吸附解析。

圖5 不同大豆肽濃度的吸附量 Fig.5 Effect of diffent soybean peptide concentrations on adsorption capacity

2.2.3 優化條件下的吸附解析特性 在最優條件(pH4.5、底物濃度為60mg/mL)下,大孔樹脂對酶解大豆肽的吸附解吸特性見圖6。由圖6可知,在吸附量較為接近的情況下,乙醇濃度為75%時,具有較好的解析率,解析率為85.5%。 通過條件的優化使得DA201-C大孔樹脂的吸附率有所增加,減少了多肽含量的損失,為下一步實驗奠定基礎。

圖6 優化條件下的吸附解吸情況 Fig.6 Effect of adsorption and desorption on the optimum condition

2.3 DA201-C大孔吸附樹脂對酶解液的動態解析特性的影響

由圖7看出,75%的乙醇在3h內能將大部分肽洗脫下來,在洗脫1h左右出現洗脫峰,在洗脫1.5～2h時洗脫曲線逐漸趨于平緩,肽的洗脫速率緩慢下降,可能由于一些相對分子質量較大的組分在75%的乙醇中溶解度較低不易被洗脫下來的緣故。洗脫下來的組分脫鹽率達到93.23%,肽回收率為88.5%。

圖7 DA201-C大孔吸附樹脂 對大豆肽的動態解析特性曲線 Fig.7 Dynamic desorption curve of soybean peptides from DA201-C macroporous resins

3 結論

DA201-C、AB-8、D3520、D4006、NAX-Ⅱ5種大孔吸附樹脂初步篩選,得出DA201-C大孔樹脂吸附解吸效果最好,并確定其最佳條件為pH4.5,底物濃度為60mg/mL,洗脫劑為75%的乙醇,脫鹽率和肽回收率都較高。大孔吸附樹脂脫鹽可以作為一種行之有效的方法,其操作簡便、價格便宜、易于再生、減少生產成本,并對產品進行了初步的分離,為進一步的分離純化和生物功能的檢測奠定基礎。

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