甘蔗醋高產菌株的篩選及鑒定

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(1.廣東輕工職業技術學院，廣州 510300；2.五華縣溢群酒業有限公司，梅州 514400；3.廣州甘蔗糖業研究所，廣州 510316)

近年來，食醋釀造朝著原料多樣化、產品功能化及多元化的趨勢發展[1]。果醋具有特殊風味以及保健功效[2-3]，逐漸占有食醋市場的重要份額。釀醋菌種是釀醋工業的關鍵因素，直接影響到生產成本和產品品質，國內外研究者在釀醋菌種選育方面已積累了豐富成果，例如，滬釀1.01和中科AS1.41是我國食醋工業應用已久的主要菌種[4-7]。然而，由于果醋原料繁多，果醋風味和釀造工藝等方面可能對釀醋菌種有更高的要求，促使了一些研究者對果醋菌種開展選育工作[8-10]。

與其它果醋釀造原料相比，甘蔗具有資源豐富、風味獨特、富含糖分及其它營養成分等優點，是釀醋的良好原料。國內研究人員已開展了一些關于甘蔗醋發酵工藝的研究，但仍沒有甘蔗醋釀造菌種篩選的報道。本實驗以自然發酵的甘蔗渣為篩選材料，對釀醋的高產菌株進行篩選與鑒定，為甘蔗醋釀造提供優良的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

自然發酵的甘蔗渣和甘蔗汁 五華縣酒業有限公司；釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CICC31143 中國工業微生物菌種保藏管理中心；DNA提取試劑盒、16S rDNA的擴增引物以及PCR擴增試劑等 深圳華大基因科技服務公司；其它試劑 均為市售；富集培養基[11]葡萄糖10g/L，酵母膏10g/L，KH2PO42g/L，MgSO40.5g/L，調節pH5.0，121℃滅菌20min，冷卻至70℃加入3%無水乙醇；分離平板培養基[12]在富集培養基的組成基礎上，另加入瓊脂20g/L和CaCO320g/L；CaCO3需預先進行干熱滅菌(160℃、30min)，與無水乙醇同時添加，盡量使之在培養基中均勻分布；斜面保藏培養基[12]組成同分離平板培養基。

SHZ-82A型恒溫水浴振蕩器 江蘇省太倉醫療器械廠；KDC-210HR高速冷凍離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司；LC-10AD高效液相色譜儀 日本島津公司；A200基因擴增儀 杭州朗基科學儀器有限公司；RDY-SP1Z核酸電泳儀 北京榮陽經典科技有限公司；GI-1凝膠成像系統 通寶達成科技(北京)有限公司；S-3000N掃描電鏡 日本日立公司。

1.2 菌株富集培養及分離純化

將10g自然發酵的甘蔗渣加入100mL富集培養基中，置于30℃、150r/min的條件下進行振蕩培養24h；然后，吸取10mL培養液轉接入90mL新鮮的富集培養基，于相同條件下培養。如此轉接2次后，將培養液稀釋涂布在分離平板培養基上，于30℃培養48h，用竹簽挑取周圍具有較大的、透明圈清晰的菌落，接入斜面保藏培養基，經培養24h，置于4℃保藏，備用。

1.3 產酸發酵篩選

參照文獻提供的方法[13]，配制產酸發酵培養基。用蔗糖調節甘蔗汁糖度至160g/L，接入釀酒酵母CICC31143，置于30℃發酵至酒精度不再上升(殘留還原糖2.0g/L以下)，用無菌水調節酒精度至6%(v/v)，加入無菌的酵母膏5g/L，并用無菌的NaOH溶液調節pH5.0，即得產酸發酵培養基。

將從分離平板挑取所得菌株的斜面菌種接入富集培養基，置于30℃、150r/min的條件下振蕩培養24h，作為種子液。按10%的接種量，將種子液接入產酸發酵培養基，于30℃、150r/min下進行發酵，至醋酸濃度不上升時結束。檢測發酵液的醋酸含量，根據產酸量篩選優良菌株。

1.4 耐酒精特性篩選

采用無水乙醇或無菌水調節產酸發酵培養基的酒精至不同濃度，分別接入10%的種子液，于30℃、150r/min下進行發酵，至醋酸濃度不上升時結束。檢測發酵液的醋酸含量，計算酒精轉化率，根據酒精轉化率篩選優良菌株。酒精轉化率的計算如下式：

酒精轉化率(%)=發酵液中醋酸含量(g/L)/發酵液中初始酒精含量(g/L)×100

1.5 傳代穩定性篩選

將上述篩選所得優良菌株的斜面菌種轉接至新鮮斜面，置于30℃培養24h，再置于4℃保藏2周，然后進行第二次轉接及保藏，如此轉接10次。同時，每次轉接的斜面菌種都用于產酸試驗。檢測發酵液的醋酸含量，比較各菌株的傳代穩定性，從而優選菌株。

1.6 優選菌株的鑒定

參照文獻的革蘭氏染色顯微鏡觀察法和掃描電鏡觀察法[14]，鑒定菌種形態特征；參照文獻提供的方法[15-16]，鑒定菌種的生理生化特征；參照文獻提供的16S rDNA鑒定方法[17]，鑒定菌種的同源性。

在16S rDNA鑒定中，引物1和引物2分別采用5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和5′-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3′；反應體系(50μL)為：10×Taq buffer 5.0μL，dNTP 1.0μL，模板 1.0μL，引物1和引物2各1.0μL，Taq酶0.5μL，ddH2O 39.5μL；PCR反應條件為：95℃預變性3min；95℃變性30s，55℃退火60s，72℃延伸60s，30個循環；72℃延伸5min，4℃保存。PCR產物經瓊脂凝膠電泳后，送至深圳華大基因科技服務公司測序，將獲得的序列在GenBank中進行同源性檢索，并采用MEGA5.1軟件以Neighbor-joining法構建系統發育樹。

1.7 測定方法

采用Lane-Eynon法[18]，測定還原糖含量；按國家標準GB/T10345-2007，采用蒸餾法和酒精計法的結合方法[19]，測定乙醇含量；采用高效液相色譜法[20-21]，測定發酵液中的醋酸含量，其測定條件為：日本島津高效液相色譜儀LC-10AD，色譜柱Hypersil C18(4.6mm×150mm，5μm)，移動相為0.002mol/L的硫酸溶液，流速為1.0mL/min，進樣10μL，檢測波長210nm。

在樣品檢測前，預先精密配制0.05、0.10、0.15、0.20、0.30、0.40、0.50g/L的乙酸標準溶液，經0.22μm濾膜過濾，按上述條件進行測定，采用外標法，以標準溶液的乙酸含量(x)和峰面積(y)繪制標準曲線，發酵液經10000r/min離心20min，取清液，經適當稀釋以及0.22μm濾膜過濾，按上述條件進行測定，再根據標準曲線方程計算醋酸含量。

2 結果與分析

2.1 產酸發酵篩選

本實驗高效液相色譜法所用標準曲線方程：y=32784.12x+648.36(相關系數R2=0.9996)，其中x為標準溶液的乙酸含量，y為峰面積。從分離平板上挑取到116株菌株，經過產酸發酵試驗，其中產酸量居前列的10株菌的發酵結果如圖1所示。由圖1看出，10株菌產酸量分布在32.8～41.8g/L的范圍內，產酸量的排序為：C22>C63>C34>C08>C75>C20>C16>C78>C03>C41。其中，菌株C22、C63、C34和C08的產酸量均超過40g/L，其中菌株C22的醋酸產量達41.8g/L，故以上菌株均優選為進一步篩選的對象。

圖1 10株菌的產酸發酵結果 Fig.1 Acetic acid production of 10 strains

2.2 耐酒精性篩選

在不同起始酒精度的培養基中，菌株C22、C63、C34和C08的酒精轉化率如圖2所示。由圖2看出，起始酒精度對醋酸菌的發酵作用有一定的影響，隨起始酒精度的增加，4株菌的酒精轉化率均呈下降趨勢。各個酒精度下的酒精轉化率可以反映出菌株的耐酒精特性，尤其在較高酒精度的條件下，各菌株的酒精轉化率表現出較明顯的差距。結果表明，4株菌耐酒精性的排序為：C22>C34>C63>C08。其中，菌株C22在起始酒精度12%(v/v)下仍具有較強的發酵作用，其醋酸產量為62.2g/L，轉化率達65.7%。

圖2 不同酒精度下的酒精轉化率 Fig.2 Result of alcohol conversion rate on different ethanol degree

2.3 傳代穩定性篩選

經過10次傳代，4株菌在起始酒精度6%(v/v)的培養基中的發酵結果如圖3所示。菌株C22、C63、C34和C08產酸的波動范圍分別為：40.6～42.4g/L、39.5～41.2g/L、39.4～41.0g/L和39.2～40.8g/L，10次傳代的產酸水平差距不大，表明各菌株具有良好的傳代穩定性。同時，在各次傳代過程中，菌株C22產酸能力居于首位，故被確認為最終優選的菌株。

圖3 不同傳代次數的醋酸產量 Fig.3 Acetic acid production of different passage times

2.4 優選菌株的鑒定

菌株C22的普通顯微鏡照片(16×100倍)和掃描電鏡照片(×12000倍)分別如圖4和圖5所示。菌體經革蘭氏染色呈陰性反應，形態呈短桿狀、單個或成對排列，菌體大小為(0.6～0.8)μm ×(1.6～2.0)μm。菌株C22的生理生化特征試驗結果見表1，根據《伯杰細菌鑒定手冊》(第八版)和《常見細菌系統鑒定手冊》的描述，初步鑒定菌株C22為醋酸桿菌屬菌種。

圖4 菌株C22在普通顯微鏡下的菌體形態 Fig.4 Cell morphology of strain C22 under ordinary microscope

菌株C22的16S rDNA的PCR擴增產物大小為1395bp，將此序列在GenBank數據庫中檢索以及進行BLAST比對，發現該序列與許多巴氏醋酸桿菌(Acetobacterpasteurium)的16S rDNA序列的同源性達到100%，采用Neighbor-joining法構建系統發育樹，如圖6所示，其中菌株C22與巴氏醋酸桿菌(登錄號：AB753861)的親緣關系最接近。將菌株C22的形態、生理生化等特征與16S rDNA鑒定結果結合起來，可最終確定菌株C22為巴氏醋酸桿菌(Acetobacterpasteurium)。

圖5 菌株C22在掃描電鏡下的菌體形態 Fig.5 Cell morphology of strain C22 under scanning electron microscope

表1 生理生化試驗結果Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain C22

3 結論

以自然發酵的甘蔗渣為篩選材料，采用分離平板、產酸試驗、耐酒精性試驗以及傳代穩定性試驗等方法，篩選獲得具有產酸高、耐酒精性強、遺傳穩定的菌株C22。菌株C22在12%(v/v)的酒精度下仍能夠表現出較強的發酵作用，在起始酒精度為6%(v/v)和12%(v/v)的培養基中，菌株C22的醋酸產量分別為41.8g/L和62.2g/L。經過形態特征、生理生化特征以及16S rDNA等方面的分析，鑒定菌株C22為巴氏醋酸桿菌。為了使菌株C22在甘蔗醋或其它果醋的釀造領域得到應用，其發酵特性仍需進一步研究。

圖6 菌株C22序列系統發育分析 Fig.6 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences of strain C22

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