響應面法優化天蠶素抗菌肽培養條件的研究

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(廣州市微生物研究所,廣東廣州 510663)

抗菌肽屬于生物體內誘導而產生的一種生物活性多肽小分子,分子量在2000～7000左右,由20～60個氨基酸殘基組成[1]。抗菌肽抗菌譜比傳統抗生素廣,抗菌活性高[2],既能抗革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌,又有抗真菌和病毒的作用[3]。

天蠶素抗菌肽在1972年首次分離得到是第一個被發現的動物抗菌肽[4],其作用機理是破壞病原菌細胞膜,從而達到抗菌作用,其作用不涉及特定靶位,因此幾乎不產生抗藥性。比起傳統抗生素,天蠶素抗菌肽具有無殘留、低耐藥性的特點,因此具有廣闊的前景。目前天蠶素抗菌肽發現大約有89種[5],部分已被利用基因工程技術方法將其表達[6]。其中利用枯草芽孢桿菌表達載體表達的天蠶素抗菌肽具有比其他抗菌肽活性更高的特點[7]。

目前,對抗菌肽的發酵已展開廣泛的研究,近年已有報道用傳統單因素法和正交設計法對天蠶素類抗菌肽的培養基進行優化[8],但該方法優化出的方案具有局限性,會忽略多個因子之間的交互作用,得到的方案通常不是最優方案。Plackett-Burman和響應面分析法,在微生物培養條件的優化工作中取得良好的效果,本研究選取8個對天蠶素抗菌肽生產菌株的相關因子進行設計,篩選出對其分泌抗菌肽顯著影響因子,再采用響應面分析的方法,以產生的抗菌肽殺菌效價為響應值,研究顯著因子對效價的影響,得到最優條件,并在500L中試水平的發酵罐上進行驗證,以期為工業生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

抗菌肽生產菌KJ05和大腸桿菌K12D31為本課題組保藏。種子培養基:甘油2%,蛋白胨2%,酵母膏1%,pH自然。發酵培養基:葡萄糖3%,蛋白胨1%,酵母膏2%,NaCl 0.5%,pH自然。固態大腸桿菌培養基:蛋白胨1%,酵母粉0.5%,NaCl 0.5%,瓊脂粉2%,pH自然。

pHS-25 數顯酸度計 上海雷磁儀器廠;ZY-3000IV抑菌圈自動測量分析儀 北京先驅威鋒技術開發公司;50L、500L不銹鋼發酵罐 上海洋格生物工程設備有限公司。

1.2 培養方法

斜面菌株活化后,接入種子搖瓶中,200r/min、30℃培養20h后接種5%到發酵培養基中,200r/min、30℃培養24h后取樣進行效價測定。

1.3 效價測定方法

配制固態大腸桿菌培養基,滅菌后冷卻至50℃時加入6mL至已滅菌平皿(Φ=75mm)中,指示菌大腸桿菌K12D31菌液(濃度約106cfu/mL)5μL加入以上平皿中,迅速震蕩搖勻,水平放置,凝固后用打孔器按指定位置(2.7mm)打孔,備用。

發酵液3000r/min離心5min后,取5μL加入到打孔處,每個樣品重復3次,37℃培養18h,用抑菌圈測定儀測定抑菌圈直徑(mm),按照下列公式進行效價計算[9]:

殺菌效價(U/mL)=2x×1000

其中x=(抑菌圈直徑-2.7)/2.1

1.4 培養基優化方法

1.4.1 Plackett-Burman法篩選影響分泌抗菌肽效價的重要因素 影響天蠶素抗菌肽分泌殺菌效價的可能因素包括:葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、氯化鈉、接種量、接種齡、初始pH以及培養溫度等8個因素,用Design Expert(version 8.0.5)軟件進行N=11的Plackett-Burman設計[10]如表1所示,通過實驗確定各因素的顯著水平。

表1 Plackett-Burman設計因子水平表Table 1 Levels and factors of Plackett-Burman design experiment

1.4.2 中心組合實驗設計 從Plachett-Burman實驗結果可知,葡萄糖、接種量、起始pH為影響分泌抗菌肽殺菌效價的關鍵因素,因此選擇該三因素作為研究對象,以抗菌肽的殺菌效價作為響應值設計中心組合實驗,軟件使用Design Expert(version 8.0.5)設計。中心組合實驗設定實驗因素水平和編碼如表2所示。并得出最優條件。

表2 實驗因素水平編碼Table 2 Factors and code levels of central composite design experiment

2 結果與分析

2.1 Plackett-Burman法篩選影響分泌抗菌肽效價的重要因素

以分泌的抗菌肽殺菌效價為響應值分別計算葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、氯化鈉、接種量、接種齡、初始pH以及培養溫度的顯著水平。按實驗因素水平,設計出N=11的Plackett-Burman實驗設計,進行14次,得到相應的天蠶素抗菌肽殺菌效價(U/mL)實驗結果見表3。并對各個因素進行顯著性分析,具體見表4。

表4 Plackett-Burman實驗各因素效應分析Table 4 Effect analysis of the Plackett-Burman design factors

從表4分析可知,因素B、F、H的p值均小于0.05,故為影響天蠶素抗菌肽效價的顯著因子。所以選擇該三個因素作為主要研究對象進行進一步優化工作,其余因素按照其相應的T值正負效應選擇高水平與低水平:酵母膏、接種齡、氯化鈉為高水平,蛋白胨、培養溫度為低水平,即以后優化培養基為:酵母膏(2.5%)、蛋白胨(1%)、氯化鈉(0.6%)、接種齡(26h)、培養溫度(30℃)。

2.2 中心組合實驗

2.2.1 最陡爬坡實驗 根據Plackett-Burman實驗的結果,選取對天蠶素抗菌肽效價影響最大的因子葡萄糖、起始pH和接種量進行最陡爬坡實驗,以確定其濃度范圍和步長。其他因子選取中心點值,根據分析計算得出葡萄糖、起始pH和接種量的步長,設計最陡爬坡實驗表如表5所示,以抗菌肽效價為響應值進行實驗。

表3 Plackett-Burman實驗設計及實驗結果Table 3 Result of Plackett-Burman design

以上6組實驗中,第三組中的抗菌肽效價最高,達12570U/mL。因此,響應面中心組合實驗設計中選取第三組數據位實驗中心點。

表5 最陡爬坡實驗設計及實驗結果Table 5 Results of steepest ascent experiment

2.2.2 中心組合實驗設計 三個主要顯著因素葡萄糖、起始pH、接種量分別設為因素A、B、C,抗菌肽效價為響應值Y,按照中心組合實驗設定實驗因素水平和編碼。設實驗中心點重復次數為6,設計中心組合實驗,并根據20組實驗條件測定各實驗組抗菌肽效價,實驗結果見表6。

根據實驗結果,利用Design-Expert軟件的分析功能進行分析如表7所示,得到編碼制的回歸方程:

Y=12639.19+605.05×A-197.04×B+605.05×C+203.13×A×B-374.37×A×C+334.38×B×C-1561.99×A2-861.95×B2-983.05×C2

通過Design-Expert軟件繪制結果響應面圖,如圖1～圖3所示,可以看出該模型具有最優解,利用軟件分析計算得最優解為:葡萄糖(5.7%),接種量(5.6%),起始pH(6.4)。

2.3 驗證實驗

對優化后培養條件進行驗證實驗:葡萄糖(5.7%),接種量(5.6%),起始pH(6.4)、酵母膏(2.5%)、蛋白胨(1%)、氯化鈉(0.6%)、接種齡(26h)、培養溫度(30℃),共進行3組250mL搖瓶實驗,實驗結果分別為:12806、13042、12710U/mL,平均效價為12852U/mL,證明該模型比較可靠,且較優化前效價提高30.7%。

表6 中心組合實驗設計及實驗結果Table 6 Result of central composite design

表7 回歸方程方差分析表Table 7 Analysis results of regression and variance

圖1 葡萄糖與接種量的響應面圖 Fig.1 Response surface curve of the interaction between glucose and inoculation amount

圖2 葡萄糖與起始pH的響應面圖 Fig.2 Response surface curve of the interaction between glucose and pH

圖3 接種量與起始pH的響應面圖 Fig.3 Response surface curve of the interaction between inoculation amount and pH

2.4 發酵中試實驗

為進一步確定該模型可靠性,在500L發酵罐上進行放大實驗。培養條件按照優化后條件,其余條件為通風量0.6～0.8m3/h,攪拌轉速為200r/min,罐壓保持0.4～0.6MPa。發酵20h后測得殺菌效價達15520U/mL,該結果明顯優于搖瓶實驗結果,推測其原因在于發酵罐培養過程中溶氧量明顯高于搖瓶,更利于菌體生長,代謝出的抗菌物質能快速擴散降低后期的反饋抑制作用。

3 結論

本文通過使用Plackett-Burman設計篩選出對天蠶素抗菌肽殺菌效價影響的顯著因子,對其再進行梯度尋優確定中心點以及步長,進一步使用中心組合實驗對顯著因子進行優化,得到回歸方程,求出最優解。優化后培養條件及培養基為:葡萄糖(5.7%),接種量(5.6%),起始pH(6.4)、酵母膏(2.5%)、蛋白胨(1%)、氯化鈉(0.6%)、接種齡(26h)、培養溫度(30℃)。優化后搖瓶殺菌效價為12852U/mL,較優化前提高了30.7%,優化后的培養基更適合KJ05的生長以及抗菌肽的合成與分泌,根據其條件進行500L發酵罐中試實驗,利用50L發酵罐作為種子培養罐,使其接種量達到5.6%,其發酵液效價能達到15520U/mL。這表明該模型較可靠,具有實際應用價值,能在今后天蠶素抗菌肽大規模生產中提供理論依據。

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