產α-葡萄糖苷酶抑制劑菌株篩選 及固態發酵條件優化

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(1.北京市食品添加劑工程技術研究中心(北京工商大學),北京 100048;2.北京市食品風味化學重點實驗室,北京 100048;3.中糧營養健康研究院,北京 100020; 4.山東龍力生物科技股份有限公司,山東禹城 251022)

α-葡萄糖苷酶抑制劑(α-glucosidase inhibitor,AGI)作為一種強的餐后血糖抑制劑,對II型糖尿病的預防表現出良好的生物活性[1]。其化學結構通常與單糖或寡糖的結構類似,通過競爭性抑制方式來抑制碳水化合物水解酶的活性。此外,α-葡萄糖苷酶抑制劑還能抑制蛋白及脂類糖基化[2],具有抗癌、抗HIV病毒、抗鼠白血病病毒、抗動脈粥樣硬化等作用[1,3]。隨著人們對α-葡萄糖苷酶抑制劑的認識不斷深入,一些含α-葡萄糖苷酶抑制劑的食品已被研究者及糖尿病消費者所認可,在飲食療法基礎上配合運動治療、藥物治療等整體治療方案,有利于減少糖尿病發病率及死亡率[4-5]。然而目前能夠用于輔助治療糖尿病的特殊功能食品種類十分有限,難以滿足急劇增長的糖尿病患者(2011年全世界糖尿病患者約3.66億,我國已有9000多萬)龐大的需求。因此開發新型、價廉、有效的能夠預防或治療糖尿病的功能性食品具有重要意義,其中含α-葡萄糖苷酶抑制劑的食品研究開發是一個重要的方向。

豆渣是大豆加工產品如豆奶或豆腐加工過程中的副產品,中國、阿根廷、巴西、美國、日本等國家每年豆渣的產量很大[6-9]。豆渣中含有多種功能性成分,如膳食纖維、大豆蛋白、多糖、異黃酮、皂甙等,具有豐富的營養價值[10]。但由于豆渣含水量較高、保質期短,這使得豆渣的利用受到一定的限制,大部分豆渣作為動物飼料直接喂養動物或者焚燒掉或者作為廢棄物堆放,不做任何利用,這造成了豆渣資源的極大浪費[11]。以鮮豆渣為原料,通過固體發酵的方式釀造具有功能特性的發酵豆渣,如具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的功能性豆渣,不僅能提高豆渣的利用價值,而且能為糖尿病患者功能性食品的研究奠定基礎。

本研究從市售發酵豆制品中篩選得到產α-葡萄糖苷酶抑制劑的菌株,并以其為發酵初始菌株固態發酵鮮豆渣,通過單因素實驗和正交實驗研究考察影響發酵豆渣α-葡萄糖苷酶抑制活性的因素,并對發酵豆渣中α-葡萄糖苷酶抑制劑的穩定性進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豆豉、腐乳、霉豆渣 均購買于全國各地不同地區的超市、農貿市場;大豆(小粒6號,2009年7月收獲) 吉林省農科院,挑選顆粒飽滿、無蟲害的大豆,所用大豆品種有:小粒6號,中黃13號,鄭90007,東農44號,中豆8號,中黃20號,豫豆25號,妥農14號,使用自來水清洗干凈,使用純凈水按1∶3的比例室溫浸泡8h,待大豆內部沒有干心后,再加入5倍于原來質量的純凈水,磨漿后取渣,現做現用(水份含量85%,粗蛋白含量3.65%,粗脂肪含量1.37%,粗纖維含量9.22%,其它物質含量0.76%);α-葡萄糖苷酶(Rat intestinal acetone powders)、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-nitrophenyl α-D-glucopyranoside,4-NPG) Sigma;其它化學試劑 均為分析純;LB培養基 胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,NaCl 10g/L,瓊脂15g/L,蒸餾水配制,調pH7.2,121℃蒸汽滅菌20min;液體種子培養基 胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,NaCl 10g/L,蒸餾水配制,調pH7.2,121℃蒸汽滅菌20min。

Model 550酶標儀 BIO-RAD Lab;T25BS4型均質機 IKALabortechnik。

1.2 實驗方法

1.2.1 α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定 在96孔酶標板上,經過稀釋的樣品中加入50μL α-葡萄糖苷酶溶液(25mg/mL),50μL 4-PNPG(0.9133mg/mL)及120μL 0.5mol/L的磷酸緩沖液(pH 6.7)。混勻后在37℃的培養箱中反應45min。加入50μL碳酸鈉溶液(0.67mol/L)終止反應,在405nm下用酶標儀測定吸光度值。樣品以相同體積的緩沖液代替所得的吸光度值作為對照。

α-葡萄糖苷酶抑制率(%)=(A對-A樣)/A對×100

式中,A對:未加樣品孔的吸光度值,A樣:加樣品孔的吸光度值。

測定冷凍干燥的發酵豆渣樣品α-葡萄糖苷酶抑制活性需要對樣品進行預處理。稱取1.0g(m0)凍干粉置于20mL蒸餾水中,冰水浴均質(15000r/min,2min)。

1.2.2 菌株的篩選

1.2.2.1 菌種的初篩 以從全國收集的45份發酵豆制品樣品為菌株來源,在無菌操作臺中,取材料(豆豉、腐乳)1g于滅菌試管中,加晾涼后的無菌水10mL,用棉塞封口,震蕩2min,稍靜置后吸取上清液1mL,稀釋10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6次,分別取0.2mL涂布LB平板。37℃培養24h觀察結果,挑選在LB培養基上的單菌落,經劃線分純后分別編號。

1.2.2.2 菌種的復篩 分別從初篩菌株平板上取一環菌,接入新鮮液體種子培養基中,37℃搖床培養24h后,測定培養液的α-葡萄糖苷酶抑制活性。

通過菌株初篩復篩得到9株細菌,分別編號為菌株1、2、3、4、5、6、7、8、9。

1.2.3 固態發酵條件的優化

1.2.3.1 接種量對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響 稱取含水量約80%的鮮豆渣(小粒6號),盛放于蒸籠中,在高壓鍋121℃滅菌20min。豆渣于無菌操作臺晾涼后,自然pH條件下分別按0%、1%、2%、3%、4%(w:w)的比例接種,于恒溫恒濕培養箱(37℃,RH 90%)中培養。發酵48h后取樣冷凍干燥備用。

1.2.3.2 pH對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響 稱取含水量約80%的鮮豆渣(小粒6號),盛放于蒸籠中,在高壓鍋121℃滅菌20min。豆渣于無菌操作臺晾涼后,調節pH分別為6.65、6.9、8.15、9.5,分別按2%(w:w)的比例接種,于恒溫恒濕培養箱(37℃,RH 90%)中培養。48h后取樣并凍干,然后測定其α-葡萄糖苷酶抑制率。

1.2.3.3 含水量對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響 鮮豆渣(小粒6號)在50℃下烘干,加入適量的蒸餾水,使得最終豆渣含水量分別為50%,60%,70%,80%,90%,在高壓鍋121℃滅菌20min。分別按2%(w:w)的比例接種,于恒溫恒濕培養箱(37℃,RH 90%)中培養。48h后取樣冷凍干燥備用。

1.2.3.4 豆渣原料品種對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響 分別挑選8種不同品種的大豆,清洗干凈、浸泡、磨漿后取渣,分別盛放于蒸籠中,在高壓鍋121℃滅菌20min 。豆渣于無菌操作臺晾涼后,2%(w:w)的比例接種,于恒溫恒濕培養箱(37℃,RH 90%)中培養。發酵48h后冷凍干燥備用。

1.2.3.5 發酵溫度對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響 稱取含水量約80%的鮮豆渣(小粒6號),盛放于蒸籠中,在高壓鍋121℃滅菌20min。豆渣于無菌操作臺晾涼后,2%(w:w)的比例接種,采用不同溫度20、25、30、35、40、45、50℃對菌株固態發酵培養,培養48h后樣品冷凍干燥備用。

1.2.3.6 發酵時間對發酵豆渣α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響 取鮮豆渣(小粒6號)200g(含水量80%),盛放于蒸籠中,在高壓鍋121℃滅菌20min 。豆渣于無菌操作臺晾涼后,按2%(w:w)的比例接種,于恒溫恒濕培養箱(37℃,RH 90%)中培養。分別在0、8、16、24、32、40、48、56、80h時取樣。凍干干燥備用。

2 結果與討論

2.1 葡萄糖苷酶產生菌株的篩選

論文作者前期研究過程中曾從食品中篩選到一株枯草芽孢桿菌B2,并對其產α-葡萄糖苷酶的抑制劑的能力展開了深入研究,并取得了一些正面的結果[12-13]。本研究在此基礎上,進一步篩選能產α-葡萄糖苷酶的抑制劑的微生物菌株,以期獲得新的產α-葡萄糖苷酶的抑制劑的菌株。從具有較強α-葡萄糖苷酶抑制活性的豆豉、豆醬及霉豆渣中初篩分離出45株細菌,經搖瓶發酵得到9株抑制活性在10%以上的菌株,結果如圖1所示。其中,菌株4和菌株5的抑制活性最強,達到50%,從形態上初步判定菌株4和菌株5為同一株菌,通過菌落形態及顯微鏡觀察發現該菌株與枯草芽孢桿菌B2有明顯不同,選擇菌株5作為進一步研究對象。

圖1 不同菌種發酵液的α-葡萄糖苷酶的抑制活性 Fig.1 Inhibitory activity of fermented culture using different strains

2.2 固態發酵條件的優化

2.2.1 接種量對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響 接種量對菌株5發酵液α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響如圖2所示。當接種量大于2%時,發酵液的α-葡萄糖苷酶抑制活性穩定在50%以上,再增加接種量對抑制活性影響差別不大,當接種量為1%以下時,發酵液的抑制活性不高,在后續實驗中將選擇接種量2%。

圖2 接種量對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響 Fig.2 Effect of inoculation on the α-glucosidase inhibitory activity

2.2.2 初始pH對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響 由圖3可見,培養基初始pH5時,菌株5發酵液的抑制活性僅為35%,抑制活性相對較低。當培養基初始pH6時,發酵液對α-葡萄糖苷酶活性達到45.7%。當初始pH7時,抑制活性最高達到56%。隨著培養基初始pH進一步增加,發酵液抑制活性又逐漸下降,到pH10時,抑制活性為37.2%。培養基初始pH調節中性范圍的時候,α-葡萄糖苷酶的抑制活性最高,偏酸性或偏堿性對α-葡萄糖苷酶的抑制活性有一定的影響,但影響程度較小。本文作者在研究液體發酵初始pH對枯草芽孢桿菌B2發酵液α-葡萄糖苷酶的抑制活性影響時發現,在酸性范圍內時,pH的變化對抑制活性的影響顯著,在pH5時,發酵液幾乎沒有α-葡萄糖苷酶的抑制活性[14],相比而言,固態發酵初始pH對α-葡萄糖苷酶的抑制活性影響不如液態發酵顯著。

圖3 pH對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響 Fig.3 Effect of pH value on the α-glucosidase inhibitory activity

2.2.3 含水量對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響 在固態發酵中,水分含量是影響菌株生長及代謝的關鍵因素之一。當豆渣含水量為80%時,α-葡萄糖苷酶抑制活性最高,達60.65%。水分對微生物生長及其產物的影響主要是由于水分對底物物理性質的作用。高于最佳水分含量將使豆渣的多孔性降低,微粒結構改變,氧氣輸送量減少;而低于最佳水分含量將導致固態底物中營養物質的可溶性下降,而微生物也得不到足夠的水分進行生長[15]。

圖4 含水量對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響 Fig.4 ffect of water content on the α-glucosidase inhibitory activity

2.2.4 豆渣品種對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響 考察8種不同品種的大豆所制備的豆渣對菌株5發酵豆渣α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響。從圖5可以看出,菌株5以不同品種的大豆豆渣進行固態發酵,均能生長良好,所得發酵豆渣的α-葡萄糖苷酶抑制活性均在50%以上,并無顯著差異。

圖5 豆渣品種對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響 Fig.5 ffect of okara variety on the α-glucosidase inhibitory activity

2.2.5 發酵溫度對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響 由圖6可見,40℃下發酵所得發酵液對α-葡萄糖苷酶抑制活性最強,達到59.3%。在35～45℃范圍內發酵液的抑制活性均較高,在40%以上。但當溫度低于35℃及高于45℃時,發酵液的抑制活性降低很快,20℃及50℃時的抑制活性分別是最高抑制活性的31.6%和21.8%。在溫度較低的情況下,菌體生長緩慢,因此當發酵進行48h后,發酵液的抑制活性仍然不高。當溫度增到50℃時,發酵液的抑制活性就顯著降低,這可能是因為高溫環境也會改變正常菌株合成α-葡萄糖苷酶抑制因子的能力[16]。

圖6 發酵溫度對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響 Fig.6 Effect of temperature on the α-glucosidase inhibitory activity

2.2.6 發酵時間對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響 由圖7可見,當發酵進行到12h時,發酵液具有一定的α-葡萄糖苷酶抑制活性,隨著發酵時間的延長,抑制活性也增加,發酵進行到48h時,抑制活性達到49.3%,進一步延長發酵時間,抑制活性增長速度緩慢。發酵進行到96h時,抑制活性達56.4%。

圖7 發酵時間對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響 Fig.7 Effect of fermentation time on the α-glucosidase inhibitory activity

3 結論

本研究從傳統發酵食品中篩選產α-葡萄糖苷酶抑制劑的菌株,并對細菌5固態發酵豆渣的發酵條件進行優化,結果表明:含水量、發酵時間、發酵溫度對發酵豆渣的α-葡萄糖苷酶抑制活性影響較大。在豆渣含水量80%,接種量2%,初始pH6～8,發酵溫度40℃的條件下發酵48h,發酵豆渣表現出較高的α-葡萄糖苷酶抑制活性。在本研究結果的基礎上,有望通過進一步研究得到含穩定有效降血糖成分的功能性食品。同時,將發酵豆渣開發成特殊用途的食品,可以大大提高豆渣的利用價值,為豆渣的開發利用開辟新途徑。

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