蕎麥蜂花粉的氧化應激防護及其活性成分分析

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(1.哈爾濱工業(yè)大學食品科學與工程學院,黑龍江哈爾濱 150090;2.國家知識產(chǎn)權局專利局專利審查協(xié)作江蘇中心,江蘇蘇州 215011;3.東北林業(yè)大學林學院,黑龍江哈爾濱 150040)

花粉作為植物的雄性生殖細胞,在植物的生命過程中具有重要作用,被賦予“植物生命之源”的稱號?；ǚ酆兄参锇l(fā)育所需要的全部營養(yǎng)物質(zhì),是很好的藥食同源食品。蜂花粉是蜜蜂采蜜帶回的花粉團,其生理活性功能在近年來得到了廣泛深入的研究?，F(xiàn)已有很多關于蜂花粉的免疫活性、抗菌、抗腫瘤和促進淋巴細胞增殖活性等研究,使其在食品、藥品、化妝品等領域得到了廣泛的應用。

蜂花粉含有豐富的多酚、黃酮、多糖、不飽和脂肪酸等生物活性物質(zhì),這些活性物質(zhì)使蜂花粉具有多種活性功能。Leja M等人的研究發(fā)現(xiàn),蜂花粉多具有較強的抗氧化活性,且其抗氧化能力與多酚含量成正相關[1]。Li F等人指出山楂蜂花粉中含有一種水溶性多糖,具有良好的免疫增強功能[2]。Medeiros K等人研究發(fā)現(xiàn)蜂花粉具有良好的抗過敏功能,且指出黃酮類物質(zhì)是主要的抗過敏活性物質(zhì)[3]。

近年來,我國有學者對蕎麥蜂花粉的活性物質(zhì)進行了純化和測定,并對其黃酮、多糖及多肽等活性成分的生理活性功能進行了一定程度的研究,指出其具有一定的抗氧化活性,但未見關于蕎麥蜂花粉氧化應激防護的系統(tǒng)報道,而國外也尚無蕎麥蜂花粉的詳細報道。本文比較了蕎麥蜂花粉水提取物和醇提取物的體外抗氧化能力以及促骨髓干細胞增殖的能力,并研究了蕎麥蜂花粉水提取物的氧化損傷防護作用,測定了其營養(yǎng)活性物質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蕎麥蜂花粉 市售級別,購于哈爾濱松霖園工貿(mào)有限公司;福林酚、ABTS、Trolox 購于sigma公司;其他無機試劑均為分析純 購于天津市科密化學試劑制造有限公司;胎牛血清和α-MEM培養(yǎng)基 生物純,購于HyClone公司。

Model 550酶標儀 美國Bio-Rad公司;HEPACLASS100 CO2培養(yǎng)箱 美國Thermo公司;LC1200液相色譜分析儀 美國Agilent公司;7890A氣象色譜分析儀 美國Agilent公司;L-8800全自動氨基酸分析儀 日本日立公司;其他儀器設備均系國產(chǎn)。

1.2 實驗方法

1.2.1 蕎麥蜂花粉提取物的制備 蕎麥蜂花粉提取物的制備參考LEBLANC B的方法,稍作改動。將蜂花粉于40℃下烘干,粉碎過40目篩。取5g蜂花粉,分別用100mL去離子水和70%乙醇進行提取。首先于4℃下磁力攪拌提5h,然后采用超聲輔助提取90min,每隔30min震蕩一次,然后放入4℃冰箱過夜。取出后3000r/min離心10min,取上清定容至100mL。活性物質(zhì)含量的測定和抗氧化實驗測定均在提取物制備7d內(nèi)完成[4]。

1.2.2 花粉提取物體外抗氧化活性的測定

1.2.2.1 清除ABTS自由基能力 ABTS母液及工作液的配制參照FAN[5]等給出的方法,在734nm下,將ABTS母液稀釋至A0=0.700～0.720,然后取0.1mL稀釋的樣品與ABTS工作液1.4mL混勻后,暗處反應6min,在734nm下測定不同梯度樣品的吸光度A。Trolox作為陽性對照。

清除能力(%)=(1-A/A0)×100

1.2.2.2 清除羥基自由基能力 在測定管中依次加入0.5mL不同濃度的樣品,1mL水楊酸(9mmol/L,50%的乙醇作溶劑),1mL硫酸亞鐵(9mmol/L),最后加入1mL雙氧水(8.8mmol/L)啟動反應,在37℃下反應30min,于510nm下測定吸光度A,空白管中不加樣品測定吸光度A0,對照管中不加雙氧水測定吸光度Ai0?？箟难釣殛栃詫φ誟6]。

清除能力(%)=(1-(A-Ai0)/A0)×100

1.2.3 蕎麥蜂花粉提取物促骨髓干細胞增殖活性研究

1.2.3.1 骨髓干細胞的提取 取150～180g的SD大鼠股骨,用新鮮培養(yǎng)液沖洗(含10%胎牛血清的α-MEM)骨髓,收集到10mL離心管中1000r/min離心10min后棄上清,加入3mL培養(yǎng)液重懸細胞,然后移入培養(yǎng)瓶培養(yǎng)24h半量換液,48h后全量換液[7-8]。待細胞融合度達到80%～90%后,用胰酶消化,傳代培養(yǎng)。

1.2.3.2 骨髓干細胞增殖實驗 用胰酶消化細胞,準確計數(shù),鋪到96孔板中(100μL/孔),經(jīng)72h后,更換培養(yǎng)液并加入5μL不同濃度的蜂花粉提取物,培養(yǎng)72h后,用MTT的方法,在490nm下測定吸光度[9-10]。

1.2.4 輻射對骨髓干細胞的氧化損傷研究 骨髓干細胞鋪于96孔板中,60Co γ-射線輻射(8Gy),在輻射前24h加入20%不同濃度(低、中、高劑量濃度分別是0.5、0.75、和1mg/mL)的蜂花粉提取物,輻射后培養(yǎng)24h后,用MTT法,在490nm下測定吸光度,計算細胞的存活率。正常組為未輻射未加藥骨髓干細胞,模型組為輻射但未加藥骨髓干細胞。

1.2.5 蕎麥蜂花粉水提取物主要成分含量分析

1.2.5.1 總多酚含量測定 參考Fan Ziluan[5]的方法測定總多酚含量,并稍作修改。以沒食子酸配制標準溶液,制作標準曲線。

1.2.5.2 總黃酮含量測定 參照FAN Ziluan[5]的方法測定總黃酮含量,并稍作修改。以兒茶素配制標準溶液,制作標準曲線。

1.2.5.3 蛋白質(zhì)含量測定 采用考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)測定蜂花粉提取物中蛋白質(zhì)含量。

1.2.5.4 總糖含量測定 總糖含量的測定參照楊曉萍等[11]提供的方法,即蒽酮-硫酸法。以D-葡萄糖為標準品,繪制總糖的標準曲線。

1.2.5.5 氨基酸組成分析 用日立L-8800型氨基酸分析儀,根據(jù)張華[12]等人的方法測定蕎麥蜂花粉水提取物中氨基酸含量。

1.2.5.6 單糖組成分析

a.單糖的水解 采用三氟乙酸將多糖分解為單糖。用5mL 2.0mol/mL的三氟乙酸(TFA)將30.0mg蕎麥蜂花粉水提取物完全溶解,封管并于110℃水解4h。待水解液冷卻至室溫,50℃減壓蒸干,加入5mL甲醇溶解,用氮氣吹干,重復溶解吹干4～5次,以完全除去TFA。

b. 單糖乙?；?糖類物質(zhì)本身沒有足夠的揮發(fā)性,本實驗將單糖衍生為具有揮發(fā)性的糖醇乙酸酯,以進行氣相色譜分析。將單糖溶液或混標液用4mL去離子水溶解,加入40mg硼氫化鈉還原3h,每30min震蕩一次。向反應液中加入適量乙酸以除去多余的硼氫化鈉。50℃減壓蒸干,加入5mL甲醇溶解,用氮氣吹干,重復溶解吹干4～5次,以除去硼酸。110℃烘干20min以除去水分。加入6mL乙酸酐和2mL吡啶,100℃反應3～5h,沉淀完全溶解后,80℃減壓蒸干,加入5mL氯仿溶解。用等體積的去離子水洗滌2～3次,除去多余的乙酸酐和其他離子,最后加入無水硫酸鈉除水后,過濾上機。

c. 單糖混和標準工作液的配制 準確稱量7種標準單糖(D-核糖,L-鼠李糖,L-阿拉伯糖,D-木糖,D-甘露糖,D-葡萄糖,D-半乳糖)各0.1000g,用去離子水定容至100mL。分別移取單糖混合標準儲備液0.25、0.50、2.50、5.0、10.0mL置于10mL棕色容量瓶中,用去離子水定容,得到濃度為0.025、0.050、0.250、0.500、1.000mg/mL的標準工作液。

d. GC-MS分析 氣相色譜條件:色譜柱為DB-5彈性石英毛細管柱(60m×0.25mm×0.25μm),程序升溫條件為初溫200℃,以25℃/min升至250℃,保持10min,載氣為He,進樣量為1μL,流速為1.0mL/min。進樣口溫度250℃,分流比1∶10。

質(zhì)譜條件:電子轟擊源EI,電子能量70eV,倍增器電壓350v,接口溫度250℃,離子源溫度150℃,四級桿溫度:230℃,質(zhì)量數(shù)掃描范圍35～450amu,用NIST02質(zhì)譜庫檢索加以確認。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 實驗數(shù)據(jù)采用平均值±標準差的形式呈現(xiàn),文中圖表采用origin8.5繪制,統(tǒng)計檢驗采用SPSS19.0軟件,差異性分析采用one-way ANOVA方法。

2 結(jié)果與討論

2.1 蕎麥蜂花粉提取物體外抗氧化活性

根據(jù)蕎麥蜂花粉水提取物和醇提取物體外清除ABTS和羥基自由基能力比較其抗氧化活性。

2.1.1 蕎麥蜂花粉提取物清除ABTS自由基活性 蕎麥蜂花粉水提取物和醇提取物清除ABTS自由基的能力如圖1所示。二者都具有一定的清除ABTS自由基的能力,且其清除活性隨濃度的增加而增強。蕎麥蜂花粉水提取物和醇提取物清除ABTS自由基活性的EC50值(清除率達到50%時,提取物的濃度)分別為13.68和12.32mg/mL。可見,水提取物清除ABTS自由基的能力高于醇提取物,但二者之間并無顯著性差異(p>0.05),不過二者均高于陽性對照Trolox(EC50值為108.47mg/mL,圖2)。

圖1 蕎麥蜂花粉水提取物和醇提取物清除ABTS自由基比較 Fig.1 ABTS scavenging capacities of water and ethanol extracts of buckwheat bee pollen

圖2 Trolox清除ABTS自由基能力 Fig.2 ABTS scavenging capacity of Trolox

2.1.2 蕎麥蜂花粉提取物清除羥自由基活性 蕎麥蜂花粉提取物清除羥自由基能力如圖3所示。水提取物和醇提取物均具有一定的清除羥自由基的能力,其中水提取物在濃度為50mg/mL時,清除率最大可達到91.90%,而醇提取物清除率最大只有9.55%?？梢?蕎麥蜂花粉水提取物清除羥自由基的能力顯著強于醇提取物(p<0.01)。然而,蕎麥蜂花粉水提取物清除羥自由基能力(EC50值為11.17mg/mL)弱于陽性對照抗壞血酸(EC50值0.30mg/mL,圖4)。

圖3 蕎麥蜂花粉水提取物和醇提取物清除羥自由基能力比較 Fig.3 Hydroxyl radical scavenging capacities of water and ethanol extracts of buckwheat bee pollen

2.2 蕎麥蜂花粉促骨髓干細胞增殖活性

蕎麥蜂花粉提取物對骨髓干細胞增殖能力的影響如圖5所示?？梢钥闯?二者均具有一定的促增殖能力。蕎麥蜂花粉水提取物濃度在1.0mg/mL時促骨髓干細胞增殖能力最大,達到74.74%;而醇提取物促骨髓干細胞增殖能力在濃度0.75mg/mL時達到最大,為28.01%?？梢钥闯?蕎麥蜂花粉水提取物比醇提取物具有更高的促骨髓干細胞增殖的能力。

2.3 蕎麥蜂花粉水提取物對輻射后骨髓干細胞存活率的影響

綜合2.1和2.2的實驗結(jié)果,可以得出蕎麥蜂花粉水提取物比醇提取物具有更好的體外抗氧化能力和促骨髓干細胞增殖能力。

表1 蕎麥蜂花粉水提物活性成分含量分析Table 1 Active components of buckwheat bee pollen

因此,以輻射誘導氧化傷害的骨髓干細胞為模型,研究了不同濃度蕎麥蜂花粉水提取物對細胞存活率的影響,來探討其對氧化傷害的防護作用,如圖6所示。

圖5 蕎麥蜂花粉水提取物和醇提取物促骨髓干細胞增殖能力 Fig. 5 Effect of water and ethanol extracts of buckwheat ee pollen on the proliferation of bone marrow stem cells

圖6 蕎麥蜂花粉水提取物對骨髓干細胞存活率的影響 Fig.6 Effect of WEBBP on viabilities of bone marrow stem cells

結(jié)果顯示,經(jīng)8Gy γ-射線輻射后,輻射模型組的骨髓干細胞存活率顯著(p<0.01)低于正常組,加藥組骨髓干細胞存活率也低于正常對照組,但只有低、中劑量組顯著(p<0.05)。加藥組骨髓干細胞的存活率顯著(p<0.05)高于輻射模型組,中、高劑量組極顯著(p<0.01),而且高劑量組與正常對照組無明顯差異,說明蕎麥蜂花粉水提取物可以保護骨髓干細胞免受輻射傷害,并能使存活率接近正常水平。這一結(jié)果與蕎麥花蜂粉水提取物體外抗氧化和促干細胞增殖活性結(jié)果一致,故可以推斷,其輻射防護作用可能與其抗氧化和促干細胞增殖活性相關。

2.4 蕎麥蜂花粉水提取物主要成分的確定

對蕎麥蜂花粉水提取物進行成分分析,用福林酚法、AlCl3法、蛋白試劑盒和蒽酮硫酸法分別測定其中總多酚含量、總黃酮含量、蛋白含量和總糖含量。

總多酚回歸方程:y=0.0026x+0.0215

式中y為760nm處溶液的吸光度;x為溶液中的沒食子酸含量(μg/mL),方程的擬和度R2=0.999。

總黃酮回歸方程:y=0.0014x+0.0154

式中y為溶液在510nm處的吸光度;x為溶液中的兒茶素含量(μg/mL),方程的擬和度R2=0.999。

總糖回歸方程:y=0.0094x+0.0081

式中：y為溶液在620nm處的吸光度;x為溶液中的葡萄糖含量(μg/mL),方程的擬和度R2=0.999。

結(jié)果如表1所示,其總糖和總蛋白質(zhì)含量較高,可以推測,蕎麥蜂花粉水溶性物質(zhì)中主要成分可能是水溶性多糖,也可能是糖蛋白。

為進一步了解蕎麥蜂花粉的抗輻射機制,通過氨基酸分析儀測定蕎麥蜂花粉水提取物中氨基酸組成,采用氣相色譜法分析其單糖組成。

對蕎麥蜂花粉水溶性成分中的蛋白質(zhì)進行氨基酸分析,氨基酸分析圖譜如圖7所示,氨基酸組成如表2所示。

圖7 氨基酸組成圖譜 Fig.7 Amino acid composition chromatograms

蕎麥蜂花粉水提取物中富含17種必需氨基酸和非必需氨基酸,占總氨基酸含量的比例在2.10%～13.30%之間。其中谷氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、蘇氨酸、絲氨酸含量較高,而蛋氨酸、組氨酸和半胱氨酸含量相對較低,這與李云捷[13]研究的玉米花粉多糖中氨基酸含量的趨勢一致,說明不同花粉其氨基酸組成類似。值得一提的是,賴氨酸可以促進造血功能[14-15],而蕎麥蜂花粉水提取物中賴氨酸的含量很高,因此可以推測,賴氨酸可能對干細胞的增殖具有促進作用,降低輻射損傷造成的干細胞死亡率。

蕎麥蜂花粉水溶性成分中,總糖是主要成分,本實驗通過GC/MS測定蕎麥蜂花粉中多糖的單糖組成,實驗結(jié)果見圖8和表3所示。

結(jié)果顯示,蕎麥蜂花粉水溶性多糖是由核糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成,其摩爾比是0.35∶0.95∶27.78∶0.93∶1.70∶13.19∶16.16。其中阿拉伯糖所占比例最高,比核糖高約79倍,其次是半乳糖、葡萄糖、木糖和鼠李糖、核糖。研究發(fā)現(xiàn),阿拉伯糖、半乳糖在植物中可以以阿拉伯半乳聚糖的形式存在,此類中性多聚糖具有明顯提高機體免疫系統(tǒng)活力,尤其對巨噬細胞吞噬作用更具有顯著促進作用。此外,阿拉伯半乳聚糖還具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用[16],而Cai Yizhong對112種抗癌中草藥提取物研究后指出,抗癌藥物普遍具有較強的抗氧化作用,而天然產(chǎn)物抗輻射的主要機制之一就是其清除自由基的抗氧化能力[17]。由此可以推斷,蕎麥蜂花粉水提取物中可能含有阿拉伯半乳聚糖,具有提高機體免疫力的作用,提高輻射防護作用,而葡萄糖、核糖可為骨髓干細胞增殖提供能量和原料。

表2 氨基酸組成分析Table 2 Amino acid composition

圖8 單糖組成圖譜 Fig.8 GC-MS chromatograms of monosaccharides

表3 單糖組成摩爾比Table 3 The molar ratio of monosaccharides

3 結(jié)論

蕎麥蜂花粉水提取物和醇提取物均具有一定的體外抗氧化活性和促骨髓干細胞增殖活性,且水提取物的活性要強于醇提取物。以輻射誘導氧化損傷的骨髓干細胞為模型,確定了蕎麥蜂花粉水提取物對氧化損傷也具有一定的防護作用。成分分析研究發(fā)現(xiàn),蕎麥蜂花粉水提取物總糖和蛋白質(zhì)含量較高,推測其主要活性成可分能為糖蛋白或水溶性多糖。本實驗為蕎麥蜂花粉天然輻射防護劑和抗氧化物的研發(fā)提供了一定的理論依據(jù),為蕎麥蜂花粉活性功能的進一步開發(fā)奠定了基礎。

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