交讓木內(nèi)生真菌JR0203代謝產(chǎn)物抗氧化及抑菌活性研究

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(1.三峽大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,湖北宜昌 443002;2.三峽大學(xué)天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點實驗室,湖北宜昌 443002)

交讓木(Daphniphyllummacropodum)是虎皮楠科的一種常綠喬木,高可達20m。主要產(chǎn)于長江流域以南各省地區(qū)及臺灣[1],散生于海拔800～1500m的較濕潤林中,常與木荷、楠木、杜英、絲栗栲、馬尾松等混生。因其新葉集生枝頂端,老葉在春天新葉長出后齊落,故名“交讓木”[2-3]。交讓木在我國傳統(tǒng)醫(yī)藥中有一定藥用價值,藥性辛、苦、涼,多有清熱解毒、活血散瘀、祛風(fēng)止痛、治瘡癤腫毒等功效,牛耳楓子還有止痢的功效[4-5]。由于該屬植物中含有很多結(jié)構(gòu)復(fù)雜而奇特的多環(huán)生物堿,受到越來越多研究者的重視[6-7]。從 20世紀(jì)60年代對交讓木開始進行生物堿成分研究至今,研究人員共從12種虎皮楠科植物中分離鑒定出13種骨架類型的生物堿128個,其中僅有少數(shù)生物堿對鼠淋巴瘤細胞株L1210表現(xiàn)出強的抑制活性,而其它大多數(shù)的虎皮楠生物堿的生物活性測試令人失望[8-9]。

內(nèi)生真菌長期生活在植物體內(nèi)的特殊環(huán)境中,并與寄主協(xié)同進化,根據(jù)內(nèi)共生理論,內(nèi)生真菌可能產(chǎn)生與宿主相同或相似的具有生物活性的次生代謝產(chǎn)物[10-12]。這些活性次級代謝產(chǎn)物具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤等生物活性,如姜廣策等[13]從中國南海紅樹中分離到的內(nèi)生真菌的發(fā)酵液粗提物具有明顯的抗菌活性。Huang等[14]從夾竹桃Neriurn oleander L中分離到42株內(nèi)生真菌,75% 的內(nèi)生真菌有抗氧化作用。目前尚未見對交讓木內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物生物活性研究的報道。本實驗采用牛津杯法測定交讓木內(nèi)生真菌JR0203代謝產(chǎn)物的各提取物的抑菌活性,并采用清除DPPH自由基(DPPH·)法和Fe3+的還原力法測定其各提取物的抗氧化活性,從而為進一步開發(fā)利用交讓木這一藥食兩用資源提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

交讓木JR0203內(nèi)生真菌(Rhizoctonia. sp.JR0203),金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,ATCC 6538),大腸桿菌(Escherichiacoli,ATCC 8739),綠膿桿菌(PseudomonsaeruginosaATCC 9027),枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisATCC 6633) 由三峽大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院微生物室提供。

DPPH(2,2-二苯基-1-苦肼基) Sigma公司;乙酸乙酯、甲醇、乙醇、石油醚、正丁醇、鐵氰化鉀、三氯乙酸、VC、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、三氯化鐵 均為國產(chǎn)分析純。

立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;GSP-9270MBE隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器;超凈工作臺 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;UV-3100型紫外可見分光光度計 上海美普達儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 PDA培養(yǎng)基:新鮮馬鈴薯洗凈去皮,切成小方塊,稱取200g,加適量水煮沸30min后過濾得濾液,加蔗糖20g,加水至1000mL,自然pH,121℃滅菌30min。

牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基:10g蛋白胨,5g牛肉膏,10g NaCl,1.5%瓊脂,加水溶解后,調(diào)pH至7.4,定容至1L,121℃ 滅菌30min。

1.2.2 種子液的制備 在無菌條件下,將JR0203菌種接種于固體PDA斜面上活化,28℃培養(yǎng)36h備用。配制1L種子液培養(yǎng)基,分裝到500mL的錐形瓶中,其裝液量為200mL,121℃滅菌30min。在無菌條件下,將PDA斜面上已活化的JR0203菌種挑取一環(huán)接種于種子液培養(yǎng)基中,在28℃,200r/min的搖床中培養(yǎng)5d左右。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng) 待種子液培養(yǎng)完后,培養(yǎng)基中長出菌絲球,再配制4L液體發(fā)酵培養(yǎng)基,分裝到500mL的錐形瓶中,裝液量為200mL,121℃滅菌30min。在無菌條件下,將種子液接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中,接種量為5%,在28℃、200r/min的搖床中培養(yǎng)觀察,直至發(fā)酵液顏色和菌絲球大小密度穩(wěn)定,即10d左右。

1.2.4 內(nèi)生真菌HS0107次生代謝產(chǎn)物提取 待發(fā)酵培養(yǎng)完后,用紗布過濾發(fā)酵培養(yǎng)基,得到發(fā)酵濾液和菌絲體。在得到的濾液中加入等體積的乙酸乙酯進行萃取,反復(fù)萃取三次,旋蒸濃縮得濾液乙酸乙酯提取物1號樣品,待用。

將晾干后的菌絲體剪碎后放入45℃烘箱中烘干,烘干后用研缽將其研碎,等分三份,分別加入甲醇、乙醇、乙酸乙酯提取,各提取劑反復(fù)提取三次,旋蒸濃縮分別得到菌絲體甲醇提取物2號樣品、菌絲體乙醇提取物3號樣品和菌絲體乙酸乙酯提取物4號樣品,待用。

比較1號樣、2號樣、3號樣和4號樣的抗氧化活性和抑菌活性,發(fā)現(xiàn)濾液乙酸乙酯提取物1號樣的抗氧化活性的DPPH IC50為0.16mg/mL,抗氧化活性高于與菌絲體各提取物,且1號樣具有一定的抑菌活性。然后對1號樣用蒸餾水分散,依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取得濾液石油醚部位5號樣、濾液乙酸乙酯部位6號樣、濾液正丁醇部位7號樣和水萃余相濃縮物8號樣,待用。

1.2.5 抗氧化活性的測定

1.2.5.1 DPPH自由基清除能力的測定 精確稱取15.8mg DPPH,溶于100mL無水乙醇,配制成0.4mmol/L的DPPH母液。依次精確量取0.1、0.15、0.20、0.25、0.30、0.5、0.75、1mL的DPPH母液稀釋至2.00mL,在517nm下測其吸光度,得標(biāo)準(zhǔn)曲線[15-16]。

將1.0mL粗樣品溶液與1.0mL 0.15mmol/L的DPPH溶液加入同一試管中,搖勻,放置30min后用溶劑做參比,測定其吸光度Ai,同時測定1.0mL 0.15mmol·L的DPPH溶液與1.0mL溶劑混合后的吸光度A0,以及1.0mL粗樣品溶液與1.0mL溶劑混合后的吸光度Aj按照下式計算清除率,清除率越大,抗氧化能力越強。

清除率(S)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100

式中:A0:未加抗氧劑時溶液的吸光度;Ai:加抗氧劑后溶液的吸光度;Aj:樣品在測定波長的吸光度。

1.2.5.2 Fe3+還原力測定 取2.5mL不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的樣品溶液,加入0.2mol/L,pH為6.6的磷酸緩沖溶液2.5mL及1%的鐵氰化鉀2.5mL,50℃水浴反應(yīng)20min后急速冷卻,加入10%三氯乙酸溶液2.5mL,再用微孔過濾器過濾,取上清液5mL,加蒸餾水4mL,及0.1% FeCl31mL,混合均勻,10min后于700nm處測定吸光值,吸光值越大則還原力越強。同時以VC作為陽性對照[17-18]。

1.2.6 抑菌活性的測定 制備菌懸液和各樣品:在無菌操作臺內(nèi),用滅菌的接種環(huán)取一環(huán)供試菌種,轉(zhuǎn)入備好的40mL無菌水中,充分振蕩以使菌細胞或菌絲分散。用血小球計數(shù)板測菌液的濃度,然后調(diào)配使其濃度為1.0×105cfu/mL。JR0203代謝產(chǎn)物的8種提取物用無菌蒸餾水稀釋定容到10mg/mL。

牛津杯法[19]:先配制好1L的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,121℃滅菌30min,然后在無菌條件下,用取0.1mL指示菌菌懸液于PDA培養(yǎng)基表面用涂布器涂布均勻,放置15min,然后取4個牛津杯均勻放置在每個平皿上,用移液槍向每個牛津杯中加入樣品50μL,每個樣品重復(fù)2個平皿,然后37℃培養(yǎng)14～17h,測抑菌直徑,計算其平均值。用無菌水做對照,測定JR0203代謝產(chǎn)物的提取物對四種指示菌的抑菌活性。

表1 JR0203代謝產(chǎn)物的提取物對DPPH·清除活性的IC50值Table 1 IC50 values of different extracts from the metabolites of JR0203 for scavenging DPPH free radicals

表2 抑菌圈直徑的平均值(cm)Table 2 The inhibitory zone diameter of different extracts from the metabolites of JR0203 (cm)

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 JR0203代謝產(chǎn)物的提取物對DPPH·清除能力的測定

按照實驗方法1.2.5.1的(1)得到DPPH和A之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線:Y=9.2637X+0.0427,R2=0.9981。由圖1可知,JR0203代謝產(chǎn)物的提取物對DPPH自由基的清除率總體趨勢是隨濃度的增加而提高,但當(dāng)濃度增加到一定值后,DPPH·清除率隨濃度的增大不再明顯提高,反而有所下降,主要原因是樣品顏色加深和溶解性問題,使得空白吸光值較大。圖1中,相同濃度的濾液乙酸乙酯提取物對DPPH·清除率效果明顯高于菌絲體甲醇、乙醇、乙酸乙酯提取物,說明清除效果較好的物質(zhì)主要集中JR0203發(fā)酵液中,其抗氧化活性物質(zhì)主要分泌在胞外。比較濾液乙酸乙酯提取物的各萃取物對DPPH·清除率效果發(fā)現(xiàn),各部位對DPPH·清除率與萃取劑的極性有一定的關(guān)系,其清除效果較好的物質(zhì)主要集中于極性適中的乙酸乙酯部位中,其乙酸乙酯部位對DPPH·清除率效果最好,與VC相當(dāng);次之為正丁醇部位,當(dāng)質(zhì)量濃度達到1.25mg/mL,其清除率達到93.87%;再次之為水萃取物,當(dāng)質(zhì)量濃度達到2.5mg/mL,其清除率達到93.43%;活性最差的為石油醚部位,當(dāng)質(zhì)量濃度達到5mg/mL,其清除率僅為11.87%。

圖1 JR0203代謝提取物對DPPH·清除率 Fig.1 Scavenging rates of different extracts from the metabolites of JR0203 against DPPH free radicals

2.2 JR0203代謝產(chǎn)物的提取物對DPPH·清除活性的IC50值的影響

由表1可知,JR0203代謝產(chǎn)物的提取物對DPPH·清除活性IC50值順序為:5>3>2>4>8>7>1>6,即石油醚部位>菌絲體乙醇提取物>菌絲體甲醇提取物>菌絲體乙酸乙酯提取物>水相部位>正丁醇部位>濾液乙酸乙酯提取物>乙酸乙酯部位。IC50的值越小說明對DPPH·的清除效果越好。在各種提取物中,濾液的乙酸乙酯萃取物對DPPH·清除活性IC50明顯小于菌絲體提取物三個樣品,而濾液的乙酸乙酯萃取物的各個部位對DPPH·清除活性IC50值順序值為:石油醚部位>水萃余物>正丁醇部位>乙酸乙脂部位。說明濾液的乙酸乙酯萃取物的乙酸乙酯部位的DPPH·清除活性最強,其IC50值為0.04 mg/mL,對DPPH·的清除活性與VC相當(dāng);次之為正丁醇部位較VC弱,IC50值約為VC的8倍;IC50值最大的為石油醚部位,達到811mg/mL,可認(rèn)為對DPPH·沒有清除活性。

2.3 JR0203代謝產(chǎn)物的提取物對Fe3+還原力的測定

還原力的測定,可檢測化合物是否為良好的電子供應(yīng)體,它所提供的電子可使Fe3+還原為Fe2+,從而使體系溶液顏色改變,即反映出體系中氧化還原狀態(tài)的改變,吸光值越大,還原力越強,抗氧化效果愈佳[18,20]。由圖2可以看出,在測定濃度范圍內(nèi),各樣品與VC溶液對Fe3+的還原為隨濃度的增加而增加。各樣品對Fe3+的還原力大小順序為6>1>7>8>4>2>3>5,即乙酸乙酯部位>濾液乙酸乙酯提取物>正丁醇部位>水萃余物>菌絲體乙酸乙酯提取物>菌絲體甲醇提取物>菌絲體乙醇提取物>石油醚部位,這與樣品對DPPH·的清除率大小順序基本一致,濾液的乙酸乙酯萃取物的乙酸乙酯部位Fe3+的還原力比其他樣品都強,略低于同濃度的VC溶液。

圖2 JR0203代謝產(chǎn)物的提取物以及VC對Fe3+的還原力曲線 Fig.2 Ferric reducing power curves of different extracts from the metabolites of JR0203

2.4 JR0203代謝產(chǎn)物的提取物的抑菌活性

由表2可知,濾液乙酸乙酯提取物的乙酸乙酯部位和濾液乙酸乙酯提取物對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、綠膿桿菌均有抑菌活性;菌絲體乙酸乙酯提取物對四種指示菌均有抑菌活性;正丁醇部位對四種指示菌也有一定抑菌活性;而菌絲體甲醇提取物、菌絲體乙醇提取物、水萃取物和石油醚部位幾乎沒有抑菌活性。

3 結(jié)論

DPPH·是一種穩(wěn)定的自由基,其在可見光區(qū)有特征吸收,比色測定簡便、快捷。自由基清除劑存在,DPPH·的單電子被配對而使其顏色變淺,在最大吸收波長處的吸光度變小,且顏色變淺的程度與配對電子數(shù)是成劑量關(guān)系的,因此可用于天然抗氧化劑的篩選[21]。本文采用清除DPPH自由基(DPPH·)法和Fe3+的還原力法測定交讓木內(nèi)生真菌JR0203代謝產(chǎn)物各提取物的抗氧化活性,然后采用牛津杯法測定各提取物的抑菌活性,發(fā)現(xiàn)濾液乙酸乙酯提取物的乙酸乙酯部位有較強的抗氧化活性,其對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和綠膿桿菌具有抑制活性。

基于濾液乙酸乙酯提取物的乙酸乙酯部位具有良好的抗氧化和抑菌活性,可對其進行正向硅膠柱、反向硅膠柱和高效液相色譜等方法繼續(xù)分離,可得到抗氧化和抑菌活性較好的單體化合物。交讓木內(nèi)生真菌JR0203可大規(guī)模液體發(fā)酵培養(yǎng),培養(yǎng)基價格低廉,培養(yǎng)條件容易控制,為天然的抗氧化劑和防腐劑的開發(fā)提供了一種新的來源。

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