一株產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌的分離鑒定及酶學(xué)特性研究

賈博涵 周偉 趙羅迪 楊埔 茍敏

（四川大學(xué)建筑與環(huán)境學(xué)院，成都 610065）

一株產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌的分離鑒定及酶學(xué)特性研究

賈博涵 周偉 趙羅迪 楊埔 茍敏

（四川大學(xué)建筑與環(huán)境學(xué)院，成都 610065）

從采集的含腐爛樹(shù)葉的土壤中，篩選到1株產(chǎn)纖維素酶能力較高的菌株JJ-3，經(jīng)16S rRNA基因序列分析，鑒定該菌株為產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌（Klebsiella oxytoca）。產(chǎn)酶條件及酶學(xué)特性研究表明：以濾紙為碳源、蛋白胨為氮源、初始pH為8.0的培養(yǎng)基中發(fā)酵3 d更利于纖維素酶的合成；菌株發(fā)酵液在中性和堿性條件下均有較高的濾紙酶活力，分別可達(dá)118.7 U/mL（pH7.0），167.8 U/mL（pH8.0）和120 U/mL（pH9.0）；所產(chǎn)纖維素酶的最適酶反應(yīng)pH為7.0，最適酶反應(yīng)溫度為40℃，對(duì)溫度比較敏感，在pH7.0-8.0的范圍內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性，能滿足中性和堿性纖維素酶的要求。

纖維素酶 產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌 產(chǎn)酶條件 酶學(xué)特性

利用秸稈等纖維素類(lèi)生物質(zhì)生產(chǎn)清潔能源及化工原料，可有效地緩解環(huán)境污染與能源危機(jī)的雙重壓力［1］。利用微生物產(chǎn)生的纖維素酶來(lái)轉(zhuǎn)化纖維素成可發(fā)酵利用的還原糖，是纖維素資源化的有效途徑。現(xiàn)有的纖維素酶大多來(lái)源于真菌和放線菌，這類(lèi)菌繁殖周期長(zhǎng)，且多產(chǎn)酸性纖維素酶［2］。

細(xì)菌產(chǎn)生的纖維素酶一般為中性或者堿性酶，因?yàn)槠鋵?duì)天然纖維素的水解能力較弱，因此對(duì)其重視不夠。近年來(lái)，隨著中性和堿性纖維素酶在洗滌、造紙、紡織和廢水處理等行業(yè)的成功應(yīng)用，細(xì)菌纖維素酶已顯示出良好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值［3］。然而，現(xiàn)有細(xì)菌纖維素酶的研究和應(yīng)用還處于起步階段，需求量較大，而且其水解活力較低，反應(yīng)成本高，難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化［4］。因此，篩選優(yōu)良的產(chǎn)纖維素酶的細(xì)菌資源對(duì)實(shí)現(xiàn)纖維素資源化具有重要意義。本研究從采集的含腐爛樹(shù)葉的土壤中篩選產(chǎn)纖維素酶能力高的菌株，旨在為獲得中性和堿性纖維素酶的菌株提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 菌株分離自四川大學(xué)江安校區(qū)內(nèi)幾處腐爛樹(shù)葉下的表層土壤。

1.1.2 培養(yǎng)基 富集培養(yǎng)基：玉米秸稈1 g，濾紙1 g，報(bào)紙0.5 g，（NH4）2SO40.2 g，酵母粉0.05 g，NaCl 0.5 g，KH2PO40.4 g，CaCl2·6H2O 0.45 g，MgSO4· 7H2O 0.03 g，蒸餾水100 mL，pH調(diào)至8.0，滅菌。

初篩培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）0.2 g，（NH4）2SO40.2 g，酵母粉0.05 g，NaCl 0.5 g，KH2PO40.4 g，CaCl2·6H2O 0.45 g、MgSO4·7H2O 0.03 g，瓊脂2 g，蒸餾水100 mL，pH調(diào)至8.0，滅菌。

發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基：CMC-Na 0.2 g，（NH4）2SO40.2 g， 酵 母 粉0.05 g，NaCl 0.5 g，KH2PO40.4 g，CaCl2·6H2O 0.45 g、MgSO4·7H2O 0.03 g，Tween-80 0.02 g，蒸餾水100 mL，pH調(diào)至8.0，滅菌。

1.2 方法

1.2.1 纖維素酶產(chǎn)生菌的分離鑒定

1.2.1.1 纖維素酶產(chǎn)生菌的富集 配制0.9%（W/V）的NaCl溶液100 mL，將采集的土壤樣品混合均勻后懸浮于NaCl溶液中，并于30℃、150 r/min條件下振蕩2 h。取10 mL靜置后的上清液接種至100 mL富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d（30℃，150 r/min），再取10 mL培養(yǎng)液接種到新鮮培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，重復(fù)多次富集。

1.2.1.2 纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選 用水解圈初篩，發(fā)酵復(fù)篩相結(jié)合的方法進(jìn)行纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選。將富集培養(yǎng)液涂布到初篩培養(yǎng)基平板上進(jìn)行菌種分離，并采用剛果紅染色法進(jìn)行初篩，挑選能夠產(chǎn)生較大透明圈的菌株。將初篩菌株接種到發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，測(cè)定濾紙酶活性，取酶活最大的菌株（命名為JJ-3）進(jìn)一步研究。

1.2.1.3 菌株鑒定及16S rRNA基因序列分析 菌株JJ-3的種屬鑒定由上海生工完成，并將菌株的16S rRNA 基因序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)。利用軟件Clustal X1.8進(jìn)行多序列比對(duì)后［5］，采用軟件MEGA-3.1構(gòu)建菌株JJ-3的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，構(gòu)樹(shù)方法為鄰連法（Neighbor-Joining），bootstrap 檢測(cè)1 000 次［6］。

1.2.2 菌株JJ-3產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

1.2.2.1 碳源對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響 以1%（W/V）的 CMC-Na、濾紙、微晶纖維素、玉米秸稈和葡萄糖為唯一碳源的發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，分別接種菌株JJ-3，發(fā)酵培養(yǎng)3 d，測(cè)定濾紙酶活性。

1.2.2.2 氮源對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響 以1%（W/V）的濾紙為唯一碳源，在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入0.25%（W/V）的不同氮源（硝酸鉀、酵母粉、蛋白胨、尿素和硫酸銨），接種菌株JJ-3發(fā)酵培養(yǎng)3 d，測(cè)定濾紙酶活性。

1.2.2.3 培養(yǎng)基pH對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響 以濾紙和蛋白胨為唯一碳氮源，調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH為5.0-9.0，分別接種菌株JJ-3發(fā)酵培養(yǎng)3 d，測(cè)定濾紙酶活性。

1.2.2.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響 以濾紙和蛋白胨為唯一碳氮源，調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH為8.0，接種菌株JJ-3分別發(fā)酵培養(yǎng)1-5 d，測(cè)定濾紙酶活性。

1.2.3 菌株JJ-3的濾紙酶酶學(xué)特性

1.2.3.1 溫度對(duì)酶活的影響及酶的熱穩(wěn)定性 將測(cè)定濾紙酶酶活的水浴反應(yīng)溫度分別設(shè)定為30℃-70℃，其它條件同1.2.4的方法測(cè)定酶活，以最高值為100%，獲得濾紙纖維素酶在不同pH條件下的相對(duì)酶活力。將粗酶液分別置于上述溫度中處理1 h后，測(cè)定剩余酶活力，以未處理的粗酶液作為對(duì)照，評(píng)價(jià)纖維素酶的熱穩(wěn)定性。

1.2.3.2 pH對(duì)酶活的影響及酶的pH穩(wěn)定性 利用磷酸緩沖液把濾紙酶酶活測(cè)定中底物溶液的pH 調(diào)節(jié)為4.0-9.0，其它條件同1.2.4的方法測(cè)定酶活，以最高值為100%，獲得濾紙纖維素酶在不同溫度下的相對(duì)酶活力。將粗酶液分別置于pH為4.0-9.0的磷酸緩沖溶液中處理1 h后，加入濾紙測(cè)定剩余酶活力，以未處理的粗酶液作為對(duì)照，評(píng)價(jià)纖維素酶的pH穩(wěn)定性。

1.2.4 纖維素酶活力的測(cè)定 菌株JJ-3以8%的接種量接種到發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，于30℃、150 r/min培養(yǎng)3 d，取發(fā)酵液于4 000 r/min離心20 min，取上清（粗酶液）測(cè)定纖維素酶活性。通常采用濾紙纖維素酶（FPase）來(lái)衡量纖維素菌酶系的綜合降解能力［7］。以濾紙為底物，應(yīng)用二硝基水楊酸法在540 nm處測(cè)定吸光度值，每組做3個(gè)平行樣，計(jì)算

FPase活力［7］。在上述條件下，每分鐘由底物生成1 μmol還原糖所需酶量定義為一個(gè)酶活力單位，用U/mL表示。

2 結(jié)果

2.1 纖維素酶產(chǎn)生菌的分離與鑒定

采用水解圈初篩，發(fā)酵復(fù)篩的方法從土壤中分離到6株產(chǎn)纖維素酶的菌株，其中菌株JJ-3合成纖維素酶的能力最高（平板培養(yǎng)3 d后，菌落直徑為0.6 cm，透明圈直徑1.3 cm，復(fù)篩時(shí)酶活為38.5 U/mL），作為后續(xù)研究的對(duì)象。

在固體培養(yǎng)基上，菌株JJ-3的菌落呈圓形，表面光滑，隆起，邊緣整齊，半透明，灰白色。經(jīng)鑒定，該菌株的16S rRNA基因序列與產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌（Klebsiella oxytoca）具有99%的序列相似性。將該序列登錄GenBank，獲得序列號(hào)為KJ801560，菌株JJ-3的系統(tǒng)發(fā)育位置見(jiàn)圖1。

圖1 菌株Klebsiella oxytoca JJ-3的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.2 菌株JJ-3發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.2.1 碳源對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響 在液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，分別以1%的 CMC-Na、濾紙、微晶纖維素、玉米秸稈和葡萄糖為唯一碳源，對(duì)菌株JJ-3進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。圖2-A顯示，上述底物存在時(shí)，菌株JJ-3都具有纖維素酶活，以濾紙為唯一碳源時(shí)FPase活性最高（59.8 U/mL），其次為葡萄糖、玉米秸稈、微晶纖維素和CMC-Na。

2.2.2 氮源對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響 考察了不同氮源（硝酸鉀、酵母粉、蛋白胨、尿素和硫酸銨）對(duì)菌株JJ-3產(chǎn)纖維素酶的影響。圖2-B顯示，以蛋白胨為氮源可獲得最大的FPase活性（182.8 U/mL），其次是酵母粉；以硝酸鉀和硫酸銨為氮源時(shí)，F(xiàn)Pase活性分別只有以蛋白胨為氮源時(shí)的17%和24.8%；尿素存在時(shí)幾乎沒(méi)有FPase活性。

2.2.3 培養(yǎng)基pH對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響 菌株JJ-3在不同pH值（5.0-9.0）的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，3 d后測(cè)定各自的纖維素酶活力。圖2-C表明，菌株JJ-3在pH值為5.0-9.0的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，均具有一定的FPase酶活性，中性和弱堿性條件更有利于獲得高活性的FPase，pH值為8.0時(shí)纖維素酶活性最高（167.8 U/mL），其次是pH值為9.0時(shí)的120 U/mL和pH值為7.0時(shí)的118.7 U/mL。

2.2.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響 菌株JJ-3在以濾紙為碳源、蛋白胨為氮源、pH值為8.0的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)不同的天數(shù)，確定最佳的發(fā)酵時(shí)間。圖2-D顯示，培養(yǎng)時(shí)間對(duì)FPase活性影響較大，發(fā)酵3 d和4 d時(shí)具有最大的FPase活性（約104 U/mL），繼續(xù)發(fā)酵則活性迅速降低，因此確定3 d是最佳的發(fā)酵時(shí)間。

2.3 菌株JJ-3的濾紙酶酶學(xué)特性

2.3.1 溫度對(duì)酶活的影響及酶的熱穩(wěn)定性 溫度對(duì)FPase酶反應(yīng)的影響（圖3）顯示，F(xiàn)Pase在30℃-50℃范圍內(nèi)具有一定活性，40℃為其最適酶反應(yīng)溫

度；溫度升高到50℃時(shí)，剩余酶活僅為33.1%；溫度繼續(xù)升高，F(xiàn)Pase活性被完全抑制。粗酶液在不同溫度保溫1 h后FPase活性均有不同程度的下降，其熱穩(wěn)定性與溫度對(duì)酶反應(yīng)的影響具有相同的趨勢(shì)（圖3），表明菌株JJ-3的纖維素酶對(duì)溫度比較敏感。

圖2 菌株JJ-3的發(fā)酵條件優(yōu)化

圖3 溫度對(duì)酶活的影響及酶的熱穩(wěn)定性

2.3.2 pH對(duì)酶活的影響及酶的pH穩(wěn)定性 pH對(duì)FPase酶反應(yīng)的影響（圖4）顯示，F(xiàn)Pase在pH值為5.0-8.0的范圍內(nèi)具有一定活性，pH值為7.0時(shí)酶活性最高，當(dāng)pH為9.0時(shí)酶活性被完全抑制，表明菌株JJ-3的纖維素酶在中性環(huán)境能更好地降解纖維素。此外，菌株JJ-3的纖維素酶對(duì)酸有一定的耐受能力。用不同的pH緩沖液處理粗酶1 h后，在pH值為7.0-8.0的范圍內(nèi)仍有50%-53%的纖維素酶活，表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性，而當(dāng)pH＞8.0時(shí)FPase活性完全喪失（圖4）。

3 討論

從自然界篩選高效的纖維素酶生產(chǎn)菌是實(shí)現(xiàn)纖維素資源化的前提和基礎(chǔ)。剛果紅平板法是最常用的識(shí)別產(chǎn)纖維素酶菌株的方法，具有直觀、快捷的優(yōu)勢(shì)。一般認(rèn)為，纖維素酶活性與剛果紅染色的透明水解圈大小（或者水解圈與菌落的直徑比值Hc）呈正比，且水解圈出現(xiàn)越早，產(chǎn)酶越快。但也有研

究表明：不同菌株的最佳產(chǎn)酶條件存在差異，即使同一菌株在液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)時(shí)也表現(xiàn)出不同的生理特性，透明圈無(wú)法完全代表菌株的產(chǎn)酶能力［8］。因此，水解圈篩選后的液體發(fā)酵或?yàn)V紙條崩解等復(fù)篩驗(yàn)證過(guò)程必不可少［9］。采用水解圈初篩，發(fā)酵復(fù)篩的方法，本研究從校園土壤中獲得一株擁有較高纖維素酶活力的產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌。產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌屬于革蘭氏陰性菌，多數(shù)研究認(rèn)為該菌具有固氮能力［10］，但對(duì)其降解纖維素的探討僅有零星報(bào)道。如蔡燕飛［11］從環(huán)境中分離出一株產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌株，對(duì)香蕉桿具有一定的降解效果。Wood等［12］發(fā)現(xiàn)產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌具有較好耐糖能力，因此利用其分解纖維素產(chǎn)生的葡萄糖來(lái)合成重要的化工原料2，3-丁二醇。因此，本研究獲得的菌株可為纖維素的利用提供有效的微生物資源。

圖4 pH對(duì)酶活的影響及酶的pH穩(wěn)定性

不同微生物生產(chǎn)纖維素酶的條件不同，因此優(yōu)化培養(yǎng)條件是提高纖維素酶產(chǎn)量的最直接有效途徑。據(jù)報(bào)道，大多數(shù)微生物來(lái)源的纖維素酶需要底物的誘導(dǎo)才能產(chǎn)生，而且容易利用碳源的存在（如葡萄糖等）會(huì)抑制纖維素酶的合成［13］。但菌株JJ-3以CMC-Na、濾紙、微晶纖維素、玉米秸稈和葡萄糖為唯一碳源時(shí)，均檢測(cè)到一定的纖維素酶活性。而且以葡萄糖為碳源時(shí)具有較好的纖維素酶活性（49.1 U/mL），說(shuō)明葡萄糖對(duì)纖維素酶的合成并未表現(xiàn)出阻遏作用。這些結(jié)果推測(cè)菌株JJ-3的纖維素酶可能為組成型表達(dá)，韓如旸等［14］報(bào)道菌株Clostridium sp. EVA1產(chǎn)生的纖維素酶也有類(lèi)似結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn)氮源對(duì)菌株JJ-3產(chǎn)酶能力的影響較大，蛋白胨是最佳的氮源，尿素幾乎完全抑制了纖維素酶的生成，說(shuō)明有機(jī)氮源比無(wú)機(jī)氮源更有利于纖維素酶的合成。也有研究發(fā)現(xiàn)纖維素降解菌Penicillium decumbens L-06的FPase活性在以蛋白胨為氮源時(shí)最高［15］。尿素為氮源會(huì)大大抑制Aspergillus sp. YN1中FPase的合成［16］。菌株JJ-3在不同pH值的發(fā)酵培養(yǎng)基中（5.0-9.0）均可合成纖維素酶，但中性和弱堿性條件獲得的FPase活性更高，基本具備作為中性和堿性纖維素酶的要求。酶學(xué)特性顯示菌株JJ-3合成的纖維素酶屬于中溫酶，在中性和弱堿性范圍內(nèi)表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性，但對(duì)溫度非常敏感。因此，后續(xù)研究可通過(guò)誘變或基因工程手段，來(lái)提高其對(duì)環(huán)境條件的耐受能力，以保證其在纖維素資源化中的應(yīng)用。

4 結(jié)論

以秸稈、濾紙和報(bào)紙為原料，經(jīng)水解圈初篩和發(fā)酵復(fù)篩，從校園含腐爛樹(shù)葉的土壤中獲得一株生產(chǎn)纖維素酶的細(xì)菌菌株，鑒定其為產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌（Klebsiella oxytoca），GenBank登錄號(hào)為KJ801560。產(chǎn)酶條件優(yōu)化結(jié)果顯示：菌株JJ-3的纖維素酶可能為組成型表達(dá)，無(wú)需底物誘導(dǎo)就能產(chǎn)生；有機(jī)氮源和中性或堿性條件更利于纖維素酶的合成；且最優(yōu)產(chǎn)酶條件如下：碳源為濾紙，氮源為蛋白胨，培養(yǎng)基初始pH為8.0，發(fā)酵3 d。酶學(xué)特性結(jié)果顯示：FPase的最適酶反應(yīng)溫度為40℃，對(duì)溫度比較敏感；最適酶反應(yīng)pH為7.0，在pH值為7.0-8.0的范圍內(nèi)仍有50%-53%的纖維素酶活，表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性，基本滿足中性和堿性纖維素酶的要求。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Isolation，Identification and Enzymatic Characterization of a Cellulase-Producing Bacteria

Jia Bohan Zhou Wei Zhao Luodi Yang Pu Gou Min
（College of Architecture and Environment，Sichuan University，Chengdu 610065）

A cellulase-producing bacteria strain JJ-3 with high activity was isolated from the soil containing rotted leaves, which was identified as Klebsiella oxytoca based on the 16S rRNA sequence analysis. The optimal enzyme-producing conditions of strain JJ-3 was investigated and was as follows：filter paper as carbon source, peptone as nitrogen source, pH8.0, three-day fermentation. And the fermentation culture had higher FPase activity under neutral and alkaline conditions, with 118.7 U/mL（pH7.0）, 167.8 U/mL（pH8.0）, 120 U/mL（pH9.0）. The results of enzymatic characterization showed that the optimal pH and temperature for enzyme reaction was 7.0 and 40℃, respectively. FPase was sensitive to temperature, while it kept good stability during the pH7.0 to 8.0. This study suggested that the cellulase from strain JJ-3 meets the request of neutral and alkaline cellulase.

Cellulase Klebsiella oxytoca Enzyme-producing conditions Enzymatic characterization

2014-05-21

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31200068）

賈博涵，男，研究方向：環(huán)境微生物工程；E-mail：jiabohanscu@163.com

茍敏，女，博士，碩士生導(dǎo)師，研究方向：有機(jī)廢棄物資源化；E-mail：gouminscu@163.com