巴豆醛對水稻懸浮培養(yǎng)細胞蛋白質(zhì)表達的影響

劉悅萍郭蓓胡昊張國慶

（1.北京農(nóng)學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，北京 102206；2.北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 102206）

巴豆醛對水稻懸浮培養(yǎng)細胞蛋白質(zhì)表達的影響

劉悅萍1郭蓓1胡昊2張國慶1

（1.北京農(nóng)學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，北京 102206；2.北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 102206）

對巴豆醛處理水稻懸浮培養(yǎng)細胞后蛋白質(zhì)組水平的變化進行了研究，以期發(fā)現(xiàn)在調(diào)控水稻細胞周期活動中起重要作用的蛋白。采用雙向電泳分離蛋白，PDQuest軟件分析凝膠圖譜確定差異蛋白點，LCQ-Fleet ion trap系統(tǒng)鑒定蛋白，相關(guān)數(shù)據(jù)庫檢索分析差異蛋白點，獲得了45個差異蛋白點，經(jīng)質(zhì)譜鑒定和數(shù)據(jù)庫分析得到26個可信蛋白，集中在脅迫反應(yīng)、蛋白質(zhì)命運，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，物質(zhì)與能量代謝和膜功能等。在這些蛋白中，小分子量熱激蛋白、Skp1蛋白和26S蛋白酶，CDC48，6-磷酸葡萄糖胺乙酰基轉(zhuǎn)移酶以及蔗糖合酶等蛋白已有文獻報告其在植物細胞周期調(diào)控中的作用，其它一些鑒定的蛋白參與了細胞的生理活動，其與細胞周期間的相互關(guān)系需進一步的研究。巴豆醛處理影響了水稻懸浮培養(yǎng)細胞正常的細胞周期活動，鑒定出部分蛋白與細胞周期的調(diào)控具有密切關(guān)系，而一些與水稻細胞分化、發(fā)育相關(guān)蛋白也得到了鑒定，其在細胞周期上的作用尚未有文獻報告，這些蛋白的進一步研究將有助于揭示水稻細胞周期的調(diào)控機制。

巴豆醛 水稻懸浮培養(yǎng)細胞 差異蛋白質(zhì)組 細胞周期

細胞分化是生物體生長發(fā)育的基礎(chǔ)。植物細胞連續(xù)的分化能力，細胞的周期活動與植物新器官的產(chǎn)生、植物的形態(tài)建成、生長發(fā)育乃至物種的繁衍有著密切的關(guān)系。水稻是我國重要的糧食作物，研究水稻細胞周期的調(diào)控機制對于有目的的改善水稻的農(nóng)藝性狀，進而提高水稻產(chǎn)量有著重要的意義。近年來，細胞周期的調(diào)控機制逐漸為人們所關(guān)注。在雙子葉模式植物擬南芥中，細胞周期關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子已經(jīng)被系統(tǒng)分析［1-4］。細胞周期蛋白間的互作已有相關(guān)研究［5］，但在單子葉模式植物水

稻（Oryza sativa）中研究則較少。根據(jù)序列的同源性，目前在水稻基因組中已經(jīng)分離到90個細胞周期關(guān)鍵調(diào)控基因［6］，這些基因分別屬于細胞周期蛋白（cyclin）、E2F轉(zhuǎn)錄因子、細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶（Cyclin-dependent kinases，CDKs）、細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶抑制劑（Kip-related protein，KRPs）和成視網(wǎng)膜瘤蛋白（Retinoblastomas，Rbs）等。蛋白質(zhì)組是指由一種生物、一個基因組、一種組織或細胞表達的所有蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)組學(xué)不但可定性也可定量分析在特定條件下蛋白質(zhì)水平的改變。通過蛋白質(zhì)組學(xué)的方法在微生物方面鑒定了與細胞周期相關(guān)的調(diào)控因子［7］。水稻基因組測序的完成及大量信息學(xué)數(shù)據(jù)的出現(xiàn)為水稻蛋白質(zhì)組學(xué)的研究提供了可能，目前已有相關(guān)的綜述報告［8］。巴豆醛（Crotonaldehyde）是一種4碳α，β-不飽和醛酮化合物，具有毒性，其容易與許多蛋白質(zhì)的殘基及DNA發(fā)生反應(yīng)形成共價性的螯合物，結(jié)果會導(dǎo)致基因突變，染色體斷裂，細胞信號通路異常，嚴重的損害將導(dǎo)致細胞凋亡或壞死，正常的細胞周期及調(diào)控受到影響［9-11］。本研究采用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，對比分析巴豆醛處理水稻懸浮培養(yǎng)細胞引起的蛋白質(zhì)表達的變化，從蛋白質(zhì)水平揭示水稻細胞周期及調(diào)控的相關(guān)因子，旨在為進一步研究水稻的生長發(fā)育機理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 水稻（Oryza sativa cv. Nipponbare）。

1.1.2 化學(xué)試劑和主要設(shè)備 pH3-10非線性固相IPG干膠條，IPG覆蓋液，瓊脂糖覆蓋液，40%的丙烯酰胺，PDA（piperazine diacrylyl），pH3-10NL兩性電解質(zhì)，碘乙酰胺，10倍的電泳緩沖液（TGS緩沖液）和SPYRO Ruby試劑均購自Bio-Rad公司。Bio-Rad公司ReadyPrepTM2-DCleanup 試劑盒，Calbiochem公司Non-Interfering Protein AssayTM試劑盒。尿素、硫脲、CHAPS和cocktail蛋白酶抑制劑購自Sigma公司，DTT和TEMED購自Merck公司。

Bio-Rad公司的PROTEAN IEF System水平電泳系統(tǒng)，PROTEAN IEF XL Cell垂直電泳系統(tǒng)和Versa-Doc Model 4000MP IMAGING SYSTEM成像系統(tǒng)。

1.1.3 溶液配制 樣品液A：20 mmol/L HEPES（pH7.5），1 mmol/L DTT，1 mmol/L EDTA和蛋白酶抑制劑復(fù)合物。

IPG泡漲液（裂解液）貯液：尿素7 mol/L，硫脲2 mol/L，CHAPS 4%和少量溴酚藍，-20℃保存，用前加DTT（最終濃度為50 mmol/L）和0.5%或1.5%（V/V）的兩性電解質(zhì)。

平衡液貯液：尿素6 mol/L，甘油30%（V/V），Tris-HCl 37.5 mmol/L（pH8.8），SDS 5%（W/V），室溫保存。平衡液A：用前向平衡液貯液中加入DTT，終濃度為2%，并加入少量的溴酚藍。平衡液B：用前向平衡液貯液中加入碘乙酰胺，終濃度為5%，并加入少量的溴酚藍。

凝膠貯液：29%丙烯酰胺和1% PDA，4℃保存。凝膠緩沖液：1.5 mol/L Tris-HCl（pH8.8）。

1.2 方法

1.2.1 試驗材料處理 水稻（Oryza sativa cv. Nipponbare）懸浮培養(yǎng)細胞的獲得參照Jenes［12］的方法，在附加2 mg/L的2，4-D的AA培養(yǎng)液中每周繼代培養(yǎng)一次。

正常細胞培養(yǎng)24 h后，加入0.6 mol/L的巴豆醛處理3 h，其它條件與正常生長細胞一致。處理后離心除去巴豆醛的培養(yǎng)液，收集細胞，保存于-80℃冰箱中。

1.2.2 懸浮培養(yǎng)細胞蛋白的提取及蛋白的定量 取一定量的懸浮培養(yǎng)細胞，加入少量石英砂，在液氮中進行研磨，取適量的研碎粉末，裝入1.5 mL的Eppendorf管中，加入樣品液（20 mmol/L HEPES，pH7.5；1 mmol/L DTT，1 mmol/L EDTA和cocktail蛋白酶抑制劑復(fù)合物），充分混合。4℃下，13 000×g離心15 min，取上清液，采用甲醇/氯仿［13］方法進行蛋白質(zhì)沉淀和除鹽處理，沉淀用IPG泡漲液溶解。

采用Non-Interfering Protein AssayTM試劑盒對蛋白質(zhì)定量，本方法用廣泛使用的沉淀劑UPPATM去除干擾，其與蛋白溶液混合后，迅速沉淀固定蛋白，顯色劑與游離的銅離子結(jié)合，顏色生成與蛋白的含量成反比，以牛血清蛋白（BSA）作為參照蛋白，

在0.5-50 mg的范圍內(nèi)，顯色與斜度一致，根據(jù)標準曲線可計算未知蛋白的含量。

1.2.3 雙向電泳分析 采用PROTEAN IEF cell等電聚焦系統(tǒng)，17 cm膠條，每根膠條的上樣液為350 μL。水化和聚焦溫度為20℃，每根膠條的限制電流為50 μA，被動水化12-15 h后進行等電聚焦，應(yīng)用的運行程序為：250 V，20 min；10 000 V，2.5 h；80 000 Vh。等電聚焦完成后，放在平衡液A和平衡液B中各平衡30 min，每次15 min。采用8%-16%的梯度膠進行第二向電泳，每塊膠恒流16 mA條件下30 min，接著恒流24 mA條件下5-6 h。取出膠進行固定，依據(jù)Bio-Rad公司SYPRO? Ruby 染色手冊進行染色。

1.2.4 凝膠圖譜分析 采用VersaDoc Model 4000MP IMAGING SYSTEM進行圖像采集。用PDQuest軟件分析凝膠圖譜，3次重復(fù)，確定差異蛋白點，然后用膠體考馬斯亮藍染色，從膠上挖取差異蛋白點。

1.2.5 質(zhì)譜蛋白鑒定和數(shù)據(jù)庫搜索 用槍頭切取差異蛋白點，使用Roche 蛋白質(zhì)組級胰蛋白酶（Trypsin）參照說明對蛋白點進行膠內(nèi)酶解。ESI-MS/MS分析在匈牙利科學(xué)院蛋白質(zhì)組研究中心進行，采用HPLC串聯(lián)離子阱質(zhì)譜儀LCQ-Fleet ion trap系統(tǒng)（Thermo Fisher Scientific）分析鑒定多肽。上樣前，色譜柱Waters Atlantis C18、100 mm×0.75 mm（Thermo）用流動相A（Milli-QH2O+0.1%甲酸）平衡，流動相B（乙氰+0.1%甲酸）300 nL/min線性梯度洗脫。采用數(shù)據(jù)依賴模式，質(zhì)譜掃描范圍m/z 400-2 000，3 個信號最強的肽段被選擇用于二級質(zhì)譜分析，5 min內(nèi)，質(zhì)量相同的肽段將不再被選擇用于二級質(zhì)譜分析。圖譜用Mascot Distiller軟件（v.2.1.1.0.）識別信號峰，用Mascot軟件（v.2.2.）搜索NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（版本是20080515）。檢索參數(shù)為：胰酶消化，物種來源設(shè)置為水稻，遺漏的酶切位點為0-2個，母離子與子離子的允許誤差均為±0.6 Da，固定修飾為酰胺甲基化（Carbamidomethyl），可變修飾為N末端蛋白質(zhì)乙酰化、N末端谷氨酸焦性沒食子酸（pyro-Glu）化和蛋氨酸氧化。單個離子得分值在55以上的蛋白是可信的。

2 結(jié)果

2.1 巴豆醛處理細胞與正常細胞圖譜分析

分別提取正常和巴豆醛處理的水稻懸浮培養(yǎng)細胞，經(jīng)過雙向電泳條件的優(yōu)化［14］，最后得到的電泳圖譜清晰干凈，紋理較少，拖尾現(xiàn)象不明顯，蛋白點主要集中在pH4-8之間。

通過雙向電泳分析巴豆醛處理對水稻懸浮培養(yǎng)細胞蛋白表達的影響，在忽略模糊點和不規(guī)則點的基礎(chǔ)上，得到正常培養(yǎng)的水稻懸浮培養(yǎng)細胞的蛋白質(zhì)中大約有889個蛋白點（圖1-A），巴豆醛處理水稻懸浮培養(yǎng)細胞的蛋白質(zhì)中大約有926個蛋白點（圖1-B）。

應(yīng)用PDQuest軟件分析巴比醛處理與對照水處理表達的差異蛋白點，共得到表達差異2倍以上、并同時在3塊膠上都存在差異蛋白點45個。

2.2 差異蛋白點的鑒定及蛋白鑒定結(jié)果

將得到的45個差異蛋白點經(jīng)酶解處理送入LCQ-Fleet ion trap系統(tǒng)進行質(zhì)譜鑒定。所得結(jié)果通過MASCOT搜索引擎進行分析，依據(jù)設(shè)定的檢索參數(shù)，45個差異蛋白點均得到鑒定，最后將鑒定蛋白點的理論等電點及分子量與雙向電泳圖譜的等電點及分子量進行綜合分析，確定26個可信蛋白質(zhì)（圖1中數(shù)字表示表達差異在2倍以上并得到鑒定的蛋白點，相同數(shù)字表示對照與處理間表達量存在差異的同一個蛋白），這些蛋白的相關(guān)表達量（圖2）顯示，spot1、2、3、5、6、7、8和9蛋白點僅在處理樣品中特異表達，spot4是處理比對照表達量上調(diào)2倍的差異蛋白點，spot10-19、22、23和26這13個

蛋白點僅在對照中有表達，spot20、21、24和25這4個蛋白點是處理后表達量下調(diào)2倍的差異蛋白，這些差異蛋白點在雙向電泳圖譜上的位置，見圖1。這些蛋白功能涉及防御相關(guān)蛋白、代謝相關(guān)的酶類、與蛋白質(zhì)命運相關(guān)及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子相關(guān)蛋白等（表1）。不同類型的蛋白表達變化不一致，既有上調(diào)的蛋白也有下調(diào)的蛋白，說明巴豆醛處理影響水稻懸浮細胞的代謝過程，相關(guān)蛋白的表達發(fā)生不同變化，

以適應(yīng)處理后的生理活動。

表1 質(zhì)譜鑒定差異表達的蛋白點

圖2 26個差異蛋白點的相對表達量

3 討論

細胞周期是真核細胞自我復(fù)制，高度保守的固有機制，植物細胞周期相關(guān)基因與植物的整個生命周期密切相關(guān)，相關(guān)研究已有綜述報道［15］。細胞凋亡過程是機體去除不需要的細胞，嚴格調(diào)控的生理過程。在人類研究上，巴豆醛處理會干擾正常的細胞周期，引起細胞的氧化脅迫，從而導(dǎo)致細胞凋亡或壞死［16，17］。在植物上利用巴豆醛研究外界毒性物質(zhì)對細胞周期影響目前鮮見報道，本研究利用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法研究了巴豆醛處理水稻懸浮培養(yǎng)細胞后蛋白質(zhì)組水平的變化，最后經(jīng)過質(zhì)譜鑒定的蛋白種類集中在脅迫反應(yīng)，蛋白質(zhì)命運相關(guān)蛋白，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白以及代謝相關(guān)蛋白這四大類別。

3.1 防御相關(guān)蛋白

水稻懸浮培養(yǎng)細胞經(jīng)過巴豆醛處理后，熱激蛋白家族中的3個小分子量熱激蛋白誘導(dǎo)上調(diào)表達（spot1-3）。小分子Hsps（sHsps）是指大小為15-30 kD 的熱激蛋白家族，在細胞中廣泛存在，主要包含9個不同的成員：Hsp27、Hsp20、HspB3、MKBP/ HspB2、HspB8、HspB9、cvHsp、α-A crystallin和α-B crystallin。盡管這個家族成員間具有較低的氨基酸同源性，但它們之間具有相似的結(jié)構(gòu)和功能［18］。目前在人類細胞上的研究表明熱激蛋白與細胞凋亡密切相關(guān)，參與細胞凋亡信號通路的多個環(huán)節(jié)，一方面，熱激蛋白主要起著抑制細胞凋亡、促進細胞存活的作用。另一方面，某些熱激蛋白又能夠作為凋亡蛋白的分子伴侶，促進細胞凋亡［19］。α-B crystallin，作為sHsps家族的成員，參與抑制細胞的凋亡，在肌原性的分化過程中，α-B crystallin被證實能夠通過抑制caspase-3的活化來遏制細胞的凋亡［20］。Liu等［21］研究表明，在過氧化氫誘導(dǎo)的CeCl2細胞系的凋亡中，α-B crystallin能夠與p53（一個促凋亡蛋白）相互作用，并抑制p53從胞質(zhì)向線粒體的轉(zhuǎn)移，抑制細胞的凋亡。本試驗中，巴豆醛處理后α-B crystallin的表達量上調(diào)。可見，其參與了巴豆醛引起的水稻懸浮培養(yǎng)細胞的脅迫反應(yīng)，抑制細胞凋亡，增加細胞在逆境條件下的存活。

Spot13是一種假定蛋白，目前的基因組研究結(jié)果將其歸于熱激蛋白家族，具體的功能未有報告。

3.2 蛋白質(zhì)合成、分解相關(guān)蛋白

植物可利用多種途徑來調(diào)控細胞內(nèi)的蛋白水平，其中泛素-蛋白酶體系（Ubiquitin-proteasome system，UPS）是主要調(diào)控途徑之一［22］，目前有報告指出UPS參與到植物生長發(fā)育的許多方面，如細胞周期，細胞調(diào)亡過程和對環(huán)境的應(yīng)答反應(yīng)等［23］。本試驗水稻懸浮培養(yǎng)細胞用巴豆醛處理后，發(fā)現(xiàn)兩個與UPS途徑相關(guān)的蛋白Skp1（spot4）和26S蛋白酶（spot17）的表達下調(diào)。有Skp1蛋白參與的Skp1/cullin/F-box（SCF）促進細胞從G1期向S期的轉(zhuǎn)變［24］。26S蛋

白酶體廣泛分布于真核細胞中的胞質(zhì)和胞核，負責(zé)細胞大多數(shù)蛋白質(zhì)的降解，在幾乎所有生命活動中具有關(guān)鍵的調(diào)控作用，主要用于降解細胞不需要的或受到損傷的蛋白質(zhì)［25］。因為蛋白酶體降解途徑對于細胞周期過程的正常運轉(zhuǎn)都是必不可少的，本試驗結(jié)果檢測到的Skp1和26S蛋白酶的表達下調(diào)，表明巴豆醛處理導(dǎo)致水稻正常的細胞周期及由巴豆醛引起的細胞調(diào)亡過程均可能受到了影響，同時也說明了泛素—26S蛋白酶體系在水稻的細胞周期運轉(zhuǎn)起到重要的調(diào)控作用，目前已有較多報道［22，26，27］，但具體的調(diào)節(jié)機制仍存在著爭議，這將是今后繼續(xù)研究的熱點問題。

Spot9是 CDC48（Cell division cycle protein 48）蛋白，是細胞周期調(diào)控的一個重要因素，是真核生物AAA 蛋白家族的一個重要成員，目前研究表明，CDC48對酵母菌、擬南芥、小鼠和人［28-31］等各種生物的細胞周期起著重要的調(diào)控作用。擬南芥CDC48主要定位在核區(qū)，通過功能缺失及顯性突變體的研究表明，擬南芥CDC48在細胞分裂、生長發(fā)育方面具有重要的調(diào)節(jié)作用［32］。煙草的NgCDC48定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，并可能參與蛋白水解過程［33］。而目前也有大量文獻報道，CDC48作為分子伴侶，也會影響細胞的凋亡過程［34-36］。目前在水稻中研究CDC48蛋白的功能未見有較多文獻報道，本試驗巴豆醛處理會導(dǎo)致CDC48蛋白表達量的上升，可能的原因是CDC48蛋白表達量的上升，其作為蛋白分子伴侶的功能活性增加，識別了在巴豆醛處理產(chǎn)生的有害的錯誤折疊的異常蛋白，與其它因子協(xié)同作用，分解掉異常蛋白，縮短了巴豆醛導(dǎo)致細胞凋亡的進程，而其真正的調(diào)控機制需要通過進一步的試驗證實。

根據(jù)質(zhì)譜的鑒定結(jié)果，在水稻懸浮培養(yǎng)細胞用巴豆醛處理后，折疊蛋白亞基3（prefoldin subunit3）的表達量上調(diào)，折疊蛋白屬于一種分子伴侶蛋白，在蛋白質(zhì)的從頭合成過程中起著重要的作用，在本試驗中的機理可能是水稻細胞響應(yīng)巴豆醛會產(chǎn)生一些響應(yīng)蛋白，折疊蛋白表達量的升高，促進響應(yīng)蛋白的正確折疊。

3.3 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白

本試驗鑒定出一個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白TGF-beta receptor-interacting protein1（TRIP-1），TRIP-1具有雙重功能，首先TGF-β因子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中具有重要的作用，在植物上已證實油菜素內(nèi)脂的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中TRIP-1發(fā)揮著重要作用［37］。另外，TRIP-1與真核生物翻譯起始因子eIF3的類似功能，在人和酵母中的研究表明，TRIP-1在調(diào)控發(fā)育、蛋白質(zhì)翻譯的起始及調(diào)控細胞周期方面具有重要的功能［38］。對擬南芥的研究表明，TRIP-1具有起始因子eIF3的功能，而TRIP-1是否具有其在類似酵母中在調(diào)控細胞分化方面的作用，目前的文獻并沒有明確的報道。在本試驗中，當(dāng)巴豆醛處理水稻懸浮培養(yǎng)細胞后，TRIP-1蛋白的表達量上調(diào)，這為研究其在水稻細胞周期過程的作用機制提供了一個有價值的信息，如何進行調(diào)控，調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)途徑需要通過進一步的試驗進行明確。

3.4 新陳代謝和能量相關(guān)蛋白

根據(jù)質(zhì)譜鑒定分析結(jié)果，本試驗共檢測到6種與糖代謝相關(guān)蛋白，包括糖酵解、三羧酸循環(huán)、戊糖磷酸途徑和其它的代謝途徑，在所檢測到的蛋白點中，spot8是6-磷酸葡萄糖胺乙酰基轉(zhuǎn)移酶，是本試驗中唯一個表達活性上調(diào)的糖代謝酶。在擬南芥的研究表明，該酶的活性與頂端生長區(qū)細胞的分裂與分化有關(guān)，用于細胞增殖所需的UDP-GlcNA和糖基磷脂酰肌醇錨［39，40］。在水稻的研究表明，此酶與根細胞的分化與植物激素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)［41］。本研究中巴豆醛處理引起該酶的活性提高，根據(jù)前人研究結(jié)果，酶活性升高是促進了細胞的分化，但本試驗用巴豆醛處理是影響了細胞的分化，因此推斷6-磷酸葡萄糖胺乙酰基轉(zhuǎn)移酶可能是細胞自我進行保護的一種方式。

其它與糖代謝相關(guān)的酶活性在巴豆醛處理后表達均下調(diào)，巴豆醛處理會導(dǎo)致糖代謝途徑部分酶活性減弱，其中spot15是核糖激酶，其與磷酸戊糖途徑有關(guān)，spot2是磷酸葡萄糖異位酶，存在于糖酵解途徑中；spot21是丙酮酸脫羧酶在無氧條件下丙酮酸的去路，spot26是順烏頭酸水解酶，是糖有氧分解檸檬酸循環(huán)途徑中的一個酶。上述酶活性的降低影響了細胞內(nèi)糖代謝水平，細胞內(nèi)的產(chǎn)能受到影響，從而導(dǎo)致細胞內(nèi)能量的匱乏，影響了正常的細

胞周期活動。spot24是蔗糖合成酶，目前有多個文獻［42，43］指出，蔗糖也是植物中的一個重要的“激素”信號分子，在細胞分裂過程中蔗糖是重要的調(diào)節(jié)物，尤其對于G1期的調(diào)控，本試驗中巴豆醛會導(dǎo)致蔗糖合成途徑中關(guān)鍵酶活性降低，可能會導(dǎo)致細胞內(nèi)蔗糖含量下降，從而影響其對細胞周期調(diào)控。

巴豆醛處理后，糖代謝相關(guān)酶活性受到影響外，還鑒定出與蛋白質(zhì)代謝途徑相關(guān)的蛋白酶（spot22和spot25），與核酸代謝相關(guān)的蛋白酶（spot19）以及與次生物質(zhì)代謝相關(guān)的蛋白酶（spot6），這些酶活性部分升高，部分降低，巴豆醛影響了細胞內(nèi)正常的代謝活動，影響了細胞正常的分裂活動。

3.5 膜活動相關(guān)蛋白

本研究用巴豆醛處理后，膜聯(lián)蛋白（annexin，spot18）的表達下調(diào)，膜聯(lián)蛋白是一種廣泛分布于動植物組織和細胞中依賴于鈣離子的磷脂結(jié)合蛋白家族，植物膜聯(lián)蛋白可參與細胞的胞吐、分泌和離子通道建立等一系列膜性活動，有關(guān)其功能及調(diào)節(jié)機制處于起步階段，有研究表明其也參與植物逆境與發(fā)育等生理活動中［44］。本試驗證實了在正常的細胞活動中，膜聯(lián)蛋白參與了細胞的分化，具體的調(diào)控機制目前無太多文獻報道，在水稻細胞中，膜聯(lián)蛋白與細胞周期活動之間關(guān)系的研究是本試驗得到的令人感興趣的問題，需要進一步的研究。

本試驗的質(zhì)譜鑒定結(jié)果有一個轉(zhuǎn)錄因子蛋白（spot7）兩個未知功能蛋白（spot10和spot16）這些蛋白在植物上的作用及其與細胞周期之間的關(guān)系需要進一步的進行研究。

4 結(jié)論

正常的水稻懸浮培養(yǎng)細胞經(jīng)過巴豆醛處理后，共檢測出45個差異蛋白點，經(jīng)過質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)庫檢索，鑒定出26個蛋白質(zhì)身份，這些蛋白是與脅迫反應(yīng)、蛋白質(zhì)命運、細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，新陳代謝和能量相關(guān)蛋白及與膜活性相關(guān)的蛋白。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Effects of Crotonaldehyde on the Protein Expression of Rice Suspension Cells

Liu Yueping1Guo Bei1Hu Hao2Zhang Guoqing1
（1. College of Biological Science and Engineering，Beijing University of Agriculture，Beijing 102206；2. Plant Science and Technology College，Beijing University of Agriculture，Beijing 102206）

In order to study the important proteins related to cell cycle of rice, the effect of crotonaldehyde on the protein expression of suspension cell line of rice was investigated. The proteins were separated by the method of two dimensional electrophoresis, the different protein spots were analyzed by PDQuest software, and then the different protein spots were identified by LCQ-Fleet ion trap and database searching. The results showed that there were forty-five protein spots expressed differently, and twenty-six of them were identified by mass spectrometry and database analysis. The predicted function of these proteins was related to stress response, protein synthesis and processing, signal transduction, metabolism membrane function. Some of the proteins, including small molecular proteins, Skp1, 26S proteasome, cell division cycle protein 48, glucosamine-6-phosphate acetyltransferase and sucrose synthase, were related with the cell cycle process. Other identified proteins should be study further to explore its function in cell cycle of rice. The normal cell cycle activity was effected by crotonaldehyde, some of the identified proteins were related with regulation of cell cycle. Other proteins related to cell differentiation had no reports about their function to cell cycle；these proteins should be study further to explore the mechanism of cell cycle regulation.

Crotonaldehyde Rice suspension cells Different proteomics Cell cycle

2014-02-20

國家自然科學(xué)基金項目（31101509）

劉悅萍，女，博士，副教授，研究方向：果實發(fā)育的蛋白質(zhì)組學(xué)；E-mail：cauping@sina.com