香蕉枯萎病菌全局性調控因子FocVeA基因的克隆及功能預測

漆艷香 張欣 陸英 張賀 蒲金基 喻群芳 謝藝賢

（中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所 農業部熱帶農林有害生物入侵監測與控制重點開放實驗室，海口 571101）

香蕉枯萎病菌全局性調控因子FocVeA基因的克隆及功能預測

漆艷香 張欣 陸英 張賀 蒲金基 喻群芳 謝藝賢

（中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所 農業部熱帶農林有害生物入侵監測與控制重點開放實驗室，海口 571101）

根據輪枝樣鐮刀菌（Fusarium verticillioides）和藤倉鐮刀菌（F. fujikuroi）veA同源基因相關序列設計引物，利用PCR與RT-PCR技術分別克隆了香蕉枯萎病菌2個生理小種的FocVeA基因序列和開放閱讀框，同時對該基因的編碼蛋白進行序列特征、系統發育與結構域分析。結果表明，2個生理小種的FocVeA基因（分別命名為F1VeA和F4VeA）的DNA片段全長分別為1 693 bp 和1 690 bp，開放閱讀框分別為1 599 bp 和1 596 bp，分別編碼532個和531個氨基酸。F1VeA和F4VeA基因預測氨基酸序列相似性均為99%，與GenBank中公布的Fusarium spp. veA基因氨基酸序列均有78%-99%相似性。系統聚類分析顯示，F1VeA和F4VeA與GenBank中已登錄的輪枝樣鐮刀菌（F. verticillioides）和藤倉鐮刀菌（F. fujikuroi）等veA同源蛋白高度同源。蛋白質保守域搜索表明，FocVeA具有veA蛋白的功能域，屬于veA蛋白家族的一員，推測該基因可能參與調控F. oxysporum f. sp. cubense的生長、毒素合成及致病性等。

香蕉枯萎病菌 FocVeA基因 克隆 序列分析

絲狀真菌次級代謝是一個復雜的多層次調控過程，次級代謝物的生物合成不僅受到途徑特異性轉錄因子及信號途徑調控性因子的調控，而且受到全局性調控因子的調控［1］。研究表明，veA基因在多

種致病真菌中調控次級代謝基因簇的表達及致病性相關毒素的生物合成，并影響病原菌的形態分化和致病性，且具有廣泛存在性及其功能的保守性，是一個重要的全局性調控因子［2-11］。迄今為止veA基因已經在許多絲狀真菌中相繼被報道，其功能和作用機制也成為一個研究熱點。

由尖孢鐮刀菌古巴專化型（Fusarium oxysporum f. sp. cubense，Foc）引起的香蕉枯萎病是一種毀滅性土傳病害，嚴重影響香蕉的產量和品質，已給中國香蕉產業造成了巨大的經濟損失。研究發現，次生代謝物毒素在尖孢鐮刀菌致病過程中起著重要作用，是重要的致病因子［12］。盡管鐮刀菌毒素在香蕉枯萎病菌致病過程中的作用已被廣泛關注，迄今尚未見到有香蕉枯萎病菌致病毒素生物合成途徑中相關調控因子的分離報道。

本研究采用同源序列法從F. oxysporum f. sp. cubense中分離veA同源基因FocVeA并進行生物信息學分析，預測FocVeA基因的蛋白結構及其功能，旨在為進一步研究該因子在香蕉枯萎病菌致病過程中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

香蕉枯萎病菌1號生理小種（F. oxysporum f. sp. cubense race 1，Foc1）和香蕉枯萎病菌4號生理小種（F. oxysporum f. sp. cubense race 4，Foc4），由中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所熱帶果樹病害課題組鑒定，保存。

1.2 方法

1.2.1 香蕉枯萎病菌基因組DNA和總RNA的制備 將供試菌株接種到PDA培養基上，28℃培養7 d，用載玻片刮取培養基表面的菌絲。分別按照BioMiga Fungal gDNA Kits和E.Z.N.A. Fungal RNA Kits說明書提取基因組DNA和總RNA。按照 M-MLV說明書操作進行cDNA第一鏈的合成。

1.2.2 香蕉枯萎病菌FocVeA基因的PCR擴增與克隆 根據同源物種輪枝樣鐮刀菌（F. verticillioides）的FvVE1基因（DQ274059）和藤倉鐮刀菌（F. fujikuroi）的FfVel1基因（FN548142）設計1對引物：AF1（5'-ATGGCTACACCATCCTCGATTCC-3'）/AR-1674（5'-CCGCCCTACTCGTCATAATACC-3'）。分別以Foc1和Foc4基因組DNA和cDNA為模板進行PCR擴增。擴增體系均為25 μL：10×PCR Buffer（Mg2+Plus）2.5 μL，dNTP Mixture（各2.5 mmol）2 μL，正向和反向引物各（20 μmol/L）各0.5 μL，高保真Taq酶（5 U/μL）0.2 μL，模板DNA（20 ng/μL）1 μL，補滅菌雙蒸水至25 μL。PCR擴增條件：94℃ 3 min；94℃ 1 min，60℃ 1 min，72℃ 1.5 min，35個循環；72℃ 10 min。PCR產物回收、連接分別按照BioMiga和TaKaRa相應的試劑盒說明書進行，陽性克隆送上海英駿公司進行測序。

1.2.3 生物信息學分析 測序結果通過NCBI的BLAST搜索數據庫進行序列同源性和保守結構域分析，用 EBI提供的在線軟件ClustalW2對目的基因所編碼氨基酸序列進行比對，使用Mega 4.1 軟件的鄰接法構建NJ 系統樹。利用Softberry（http：//www. softberry.com/）、ExPASy（http：//www.expasy.org/）、WoLF PSORT（http：//www.genscript.com/psort/wolf_ psort.html/）、Euk-mPLoc 2.0、GOR4、SWISS-MODEL Repository（http：//swissmodel.expasy.org/repository/）等網上綜合軟件包，對目的基因分別進行編碼蛋白的理化性質、細胞內定位、跨膜結構域、磷酸化位點分析和功能結構特點分析。

2 結果

2.1 基因克隆與序列分析

分別以Foc1和Foc4基因組DNA為模板，用引物AF1和AR1674進行PCR擴增，分別獲得長約1 700 bp的條帶（圖1）。以cDNA為模板用AF1和AR1674引物進行PCR，分別獲得長約1 600 bp的條帶（圖2）。

圖1 FocVeA基因DNA PCR擴增

圖2 FocVeA基因cDNA RT-PCR擴增

擴增條帶的陽性克隆經PCR擴增鑒定后進行多個個體測序，序列保持一致。核苷酸序列分析表明，以基因組DNA為模板時，PCR擴增產物大小分別為1 693 bp和1 690 bp，以cDNA為模板時，PCR擴增產物大小分別為1 599 bp和1 596 bp。將DNA序列與cDNA序列進行比對，發現2個小種的FocVeA基因均含有包含1個內含子和2個外顯子，內含子長度均為94 bp，這與F. verticillioides的FvVE1和F. fujikuroi的FfVel1基因結構一致。2個小種的FocVeA基因DNA序列已提交GenBank（登錄號分別為：KF745043和KF745042），并分別命名為F1VeA和F4VeA。

2.2 FocVeA預測蛋白理化性質分析

利用ExPASy網站的Protparam程序對蛋白質進行組分分析，結果顯示F1VeA和F4VeA基因分別編碼532和531個氨基酸，只有一個氨基酸的差異，相對分子質量分別為59.28 kD 和59.17 kD；理論等電點分均為9.06。其中正電荷氨基酸殘基（Arg+Lys）總數均為66，負電荷殘基（Asp+Glu）總數均為59，非極性氨基酸殘基（AILMFPWV）總數分別為204和203，極性氨基酸殘基（NCQGHSTY）總數均為203，不穩定系數分別為74.79和75.28，半衰期均為30 h，說明FocVeA蛋白為不穩定的微堿性蛋白。應用Hphob./Kyte & Doolittle算法，預測2個小種的FocVeA蛋白疏水性平均值分別為-0.929和-0.928，脂溶指數分別為54.1和54.2，說明FocVeA屬于脂溶性、親水性蛋白。

2.3 FocVeA預測蛋白同源性分析

經Blast同源性分析，F1VeA和F4VeA基因序列和預測的氨基酸序列相似性均為99%，與輪枝樣鐮刀菌（F. verticillioides）的FvVE1（ABC02879.1）、藤倉鐮刀菌（F. fujikuroi）的FfVel1（CBE54373.1）和禾谷鐮刀菌（F. graminearum）的FgVe1（ADQ27445.1）等veA蛋白高度同源，相似性高達78%-99%，而與其它屬的veA蛋白同源性較低，只有41%-63%的相似性。系統聚類結果（圖3）表明，香蕉枯萎病菌2個生理小種的FocVeA優先與3種鐮刀菌聚為一類，置信度為100%，親緣關系最近，由此推測FocVeA蛋白屬于veA蛋白家族成員。

圖3 香蕉枯萎病菌FocVeA蛋白與其它絲狀真菌veA蛋白序列進化樹

2.4 FocVeA預測蛋白結構分析

2.4.1 保守結構域分析 利用NCBI的Blast軟件（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/structure/cdd/wrpsb.cgi）進行FocVeA推導性蛋白結構域分析，結果（圖4）表明，該蛋白保守區序列集中于蛋白質的N端，且N-末端都包含一個推測的絲絨蛋白超級家族區域

（VSFD）和一個雙組分核定位信號NLS區域；同時該蛋白的C-末端有一個富含脯氨酸（P）、谷氨酸（E）、絲氨酸（S）和蘇氨酸（T）的潛在PEST結構域（PM），由此推測FocVeA屬于veA蛋白家族。

圖4 幾種鐮刀菌屬真菌veA蛋白保守結構域氨基酸序列的比較

2.4.2 跨膜區與信號肽分析 用Tmpred Server對FocVeA氨基酸序列進行預測，結果顯示，F1VeA與F4VeA均無跨膜區。經SingaIP進行信號肽預測顯示，該氨基酸序列無信號肽位點，不屬于分泌蛋白。此外，WoLFPSORT和Euk-mPLoc兩種不同的網絡工具進行亞細胞定位預測表明，FocVeA中存在一個雙組分核定位信號NLS區域，顯示該基因定位于細胞核中。

2.4.3 功能結構域分析 利用GOR4在線分析顯示，F1VeA 與 F4VeA分別含12.41%和12.43%的α-螺旋，12.22 %和12.24%的延伸鏈，75.38%和75.33%的無規則卷曲，二者均無β折疊和β轉角，表明FocVeA蛋白的二級結構主要為α-螺旋和無規則卷曲。此外，通過NetPhos 2.0的有磷酸化位點預測顯示，F1VeA與F4VeA蛋白的絲氨酸（Ser）磷酸化位點分別為37個與38個，酪氨酸（Tyr）磷酸化位點分別為10個與9個，而蘇氨酸（Thr）磷酸化位點均為12個，這些位點的存在說明蛋白翻譯后修飾對FocVeA蛋白功能的完成或改變起到重要作用。

3 討論

尖孢鐮刀菌產生的毒素是一種具有毒性的次級代謝產物，在尖孢鐮刀菌致病過程中起重要作用，是重要的致病因子。香蕉枯萎病菌在致病過程中產生的毒素（如鐮刀菌酸，FA）在病菌侵入寄主后，可導致維管束細胞產生褐變、壞死等病理變化［13］。目前對香蕉枯萎病菌毒素的相關研究和報道集中在粗毒素成分［14，15］、鈍化物篩選［16，17］、抗病突變體篩選［18］、與毒素泵出相關轉運蛋白foABC1基因的克隆及序列分析［19］等研究，但迄今為止，有關香蕉枯萎病菌致病毒素生物合成途徑中相關調控因子的分離仍未見報道。

全局性調控因子veA是在絲狀真菌中普遍存在的調控因子之一，對絲狀真菌生長發育、毒素等次級代謝產物的合成以及致病性等重要的生命過程起調控作用［20］。目前veA同源基因已相繼在一些絲狀

真菌中被克隆分析，但在不同的真菌中，即使是曲霉的不同種中，veA蛋白的功能也有很大差異。如構巢曲霉（Aspergillus nidulans）veA、黃曲霉（A. flavus）veA、寄生曲霉（A. parasiticus）veA、輪枝樣鐮刀菌（F. verticillioides）FvVE1、禾谷鐮刀菌（F. graminearum）FgVEA、藤倉鐮刀菌（F. fujikuroi）FfVel1、小麥殼針孢病菌（M. graminicola）MVE1、頂頭孢霉（ Acremonium chrysogenum）AcVEA均為veA同源基因，但突變后的表型卻有差異。

研究發現，veA基因參與絲狀真菌菌絲生長及產孢過程。在曲霉中，A. nidulans 的veA敲除突變體（△veA）表現異常，且在有利于有性繁殖的條件下培養也不產閉囊殼，卻產生大量分生孢子［2］。A. flavus的△veA也具有相似的表型，表現為分生孢子產量增加，菌核產量減少［3］。而A. parasiticus的△veA除分生孢子和菌核產量均減少外，還完全喪失了產橫隔能力［4］。在鐮刀菌中，△FvVE1除氣生菌絲生長和菌落表面疏水性受抑制和菌絲極性改變外，還出現大型分生孢子與小分生孢子的比例增大現象［5，6］。在赤霉病菌中也有類似的現象，△FgVEA氣生菌絲減少，疏水性降低，但其產孢量增加，孢子萌發延遲［7，8］。而△FfVel1氣生菌絲和分生孢子數則減少，子囊殼數量則增多［9］。△MVE1與FvVEl類似，具體表現為氣生菌絲減少，不受光照影響，液體培養下菌絲膨脹、極性改變［10］。與野生型相比，△AcVEA分生孢子形成提前，菌絲頂端呈高度分枝狀［11］。由此說明veA在不同菌體中調控形態發育的機制可能有所差異。

研究還發現，veA基因參與調控絲狀真菌毒素及色素等次級代謝產物的合成。在曲霉中，A. nidulans的△veA除完全喪失產柄曲霉毒素（ST）能力外，青霉素產量較野生型菌株也大大降低［21］。A. flavus的△veA幾乎抑制了黃曲霉毒素生物合成過程所有的調控基因的表達，從而完全喪失了產黃曲霉毒素的能力［3］。在鐮刀菌中也有相似現象，△FvVE1的煙曲霉毒素、串珠鐮刀菌毒素的合成下降、伏馬毒素合成中調控因子的表達也受抑制［5，6］；△FgVEA紅色色素合成呈顯著上升，但單端孢霉烯的合成顯著降低［7，8］。△FfVel1的色素比卡菌素合成上升，但伏馬毒素、赤霉素以及鐮刀菌素C合成受抑制［9］；△AcVEA的孢菌素C的產量明顯減少［11］。上述研究說明veA基因在多個絲狀真菌中正調控次生代謝的合成。

另外，veA基因還影響絲狀真菌的致病性。A. flavus的△veA致病力顯著下降，因而不能在種子上正常定殖［22］。△FgVEA致病力喪失，以致菌體無法在麥穗上擴展侵染［7，8］。同樣，接種△FfVel1后的水稻葉片也沒有表現出惡苗癥狀［9］；而在小麥殼針孢病菌中，△MVE1的致病性卻沒有改變［10］。這些研究結果說明veA在不同絲狀真菌致病過程中的作用也各不相同。

Foc1和Foc4在侵染不同種的香蕉時存在較大的差異，Foc1只侵染粉蕉而Foc4幾乎能侵染所有香蕉品種。本研究獲得了香蕉枯萎病菌2個生理小種的FocVeA基因，且F1VeA和F4VeA的推測編碼蛋白僅1個氨基酸的差異，即F1VeA的潛在PEST結構域比F4VeA多了一個脯氨酸（P）。PEST結構域與蛋白快速折疊有關［9］，由此說明FocVeA基因有可能是造成寄主差異和致病力差異的主要原因之一。其次，F1VeA和F4VeA的推測蛋白序列與veA同源基因FvVE1、FfVel1及FgVEA編碼蛋白高度相似，但該基因是否與香蕉枯萎病菌的生長發育、毒素合成及致病性相關，還有待進一步研究證實。

4 結論

本研究通過同源序列法獲得了香蕉枯萎病菌全局性調控因子FocVeA基因序列和開放閱讀框，結果表明，2個生理小種F1VeA和F4VeA的DNA片段全長分別為1 693 bp 和1 690 bp，分別編碼532個和531個氨基酸，預測氨基酸序列相似性均為99%，系統聚類分析顯示，F1VeA和F4VeA與GenBank中已登錄的輪枝樣鐮刀菌（F. verticillioides）和藤倉鐮刀菌（F. fujikuroi）等veA同源蛋白高度同源。蛋白質保守域搜索表明，FocVeA具有veA蛋白的功能域，屬于veA蛋白家族的一員，推測該基因可能參與調控F. oxysporum f. sp. cubense的生長、毒素合成及致病性等。

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（責任編輯 馬鑫）

Cloning and Functional Prediction of the Global Regulator FocVeA Gene from Fusarium oxysporum f. sp. cubense

Qi Yanxiang Zhang Xin Lu Ying Zhang He Pu Jinji Yu Qunfang Xie Yixian
（Key Laboratory of Monitoring and Control of Tropical Agricultural and Forest Invasive Alien Pests，Ministry of Agriculture，Environment and Plant Protection Institute，CATAS，Haikou 571101）

Based on the conserved amino acid sequence of veA homologs from F. verticillioides and F. fujikuroi, FocVeA gene and its open reading frame of F. oxysporum f. sp. cubense race 1 and race 4（Foc1 and Foc4）were cloned by PCR and RT-PCR. Sequences characterization, phylogenetic clustering and conserved domains on the two predicted proteins of FocVeA gene were also analyzed, respectively. The results showed that the complete DNA sequences of FocVeA from Foc1 and Foc4（named as F1VeA and F4VeA）were 1 693 bp and 1 690 bp, respectively. The cDNA of F1VeA and F4VeA were 1 599 bp and 1 596 bp, and encoded a deduced protein of 532 amino acid and 531 amino acid, respectively. The deduced amino acid sequences of F1VeA and F4VeA shared 99% similar to each other, and had 78%-99% similarity with the sequences of veA factor from isolates of Fusarium spp., respectively. Phylogenetic clustering suggested that the amino acid sequences of F1VeA and F4VeA showed high similarity to veA homologs of F. verticillioides and F. fujikuroi deposited in GenBank. Conservative structure domain analysis showed that F1VeA and F4VeA had the sequence characteristics of veA gene family in filamentous fungi, which meant that FocVeA might involve in morphological development, toxin biosynthesis and pathogenicity of F. oxysporum f. sp. cubense.

Fusarium oxysporum f. sp. cubense FoVeA gene Cloning Sequence analysis

2014-03-20

現代農業產業技術體系建設專項資金（CARS-32-04），中央級公益性科研院所基本科研業務費專項資金（2013hzs1J009）

漆艷香，女，博士，副研究員，研究方向：熱帶果樹病害的診斷、病原學及防治；E-mail：qiyanxiang@126.com

謝藝賢，男，研究員，研究方向：熱帶果樹病害及防治；E-mail：yixian81@126.com