響應面法優化放線菌產纖維素酶發酵條件

曾柏全，許志，張陽陽

（中南林業科技大學生命科學與技術學院，湖南長沙410004）

響應面法優化放線菌產纖維素酶發酵條件

曾柏全，許志，張陽陽

（中南林業科技大學生命科學與技術學院，湖南長沙410004）

采用紫外與60Co-γ射線誘變獲得的高產纖維素酶菌株系為研究對象，研究產纖維素酶的發酵條件，結果表明：通過單因素實驗，確定復合碳源，蛋白胨，KH2PO43個因素的取值范圍。利用SAS9.1軟件對碳源、氮源以及KH2PO4進行響應面分析。結果表明：X1（氮源）=4.05g，X2（復合碳源）=3.69g，X3（KH2PO4）=4.68%，CMCase最大酶活為94.8688IU/mL。

放線菌；纖維素酶；響應面

纖維素類物質是自然界中存在的最廉價、最豐富的一類可再生資源[1]。纖維素酶（celluase）可廣泛用于食品、紡織、造紙、洗滌、飼料、釀酒、石油勘探、中藥成分提取、生物能源等眾多領域，特別是在紡織、洗滌、造紙和生物能源等工業應用上具有重要地位[2-3]。肖舫[4]等通過對發酵條件優化，使羧甲基纖維素鈉活性達到1.548 IU/mL。陳偉紅[5]經過誘變選育后進行發酵條件優化將FPAase酶活提高到40.8 IU/mL。佟勇[6]等篩選出嗜熱放線菌，并對其進行發酵條件優化，獲得較高的纖維素酶活。目前，大量的纖維素物質沒有被利用，運用纖維素酶對纖維素進行充分利用，將農副產品如糠醛渣、蔗糖渣、造紙廢料等纖維素材料轉化成糖和蛋白質，對緩解全球能源危機，食品和飼料資源緊張以及環境污染有著重大意義[7]。本實驗鑒于纖維素酶酶活不高，纖維素酶供不應求，對產酶發酵條件進行優化，來提高纖維素酶活。

1 材料與方法

1.1 培養基

斜面培養基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20 g，水1 000mL；篩選培養基：CMC-Na 20 g，（NH4）2SO42.0 g，MgSO4·7H20 0.5g，KH2PO41 g，NaCl0.5 g，剛果紅0.4 g，瓊脂20 g，水1 000mL；發酵產酶培養基：蛋白胨3.0 g，酵母浸出膏0.5 g，（NH4）2SO42.0 g，KH2PO44.0 g，CaCl20.3 g，MgSO4·7H20 0.3 g，CMC-Na 20 g，水1 000mL。

1.2 主要實驗儀器

全自動高壓蒸汽滅菌器：DAIHAN LABTECH Co.，LTD；SW-CJ-1F型水平超凈工作臺：江蘇蘇凈集團安泰公司；PYX-280S-A型生化培養箱：寧波江南儀器廠；TGL-16高速臺式冷凍離心機：湘江儀器廠；UV-1700紫外可見分光光度計：日本島津公司；60Co-γ放射儀：湖南省原子能研究所。

1.3 實驗方法

1.3.1 培養方法

將菌株由斜面接種到50mL種子培養基的250mL錐形瓶中，于30℃，175 r/min的條件下培養3 d。然后按4%的接種量接入裝有60mL產酶培養基的250mL錐形瓶中，于30℃、180 r/min的條件下培養6 d。

1.3.2 纖維素酶活力的測定

酶活測定均用DNS法[8]測定酶解產生的還原糖量，酶活單位采用國際定義[9]方法：其中CMC酶活和FPA酶活在50℃，pH6.0條件下，以1mL酶液1min分解底物生成1μmol葡萄糖的酶量定義為1個酶活單位。

2 結果與分析

2.1 發酵條件優化

2.1.1 分析因素的選取以及分析方案

通過復合誘變的初篩與復篩最終得到突變株UV-Co16，以此菌株進行后續試驗。經過單因素實驗選取對發酵條件影響較大的碳源、氮源、磷酸鹽為自變量，并以+1，0，-1代表自變量的高，中，低水平，以CMCase為響應值。實驗因素和水平設計見表1，實驗方案以及結果見表2。

表1 響應面分析因素與水平表Table1 Factors and Levels for Box-Behnken design

表2 響應面分析方案及實驗結果Table2 Program and experimental results of Box-Behnken design

2.1.2 回歸方程的建立與分析

利用SAS9.1軟件（Analysis of variance）ANOVA程序對表3數據進行二次回歸分析，結果見表3，剔除不顯著的影響因素，即影響因素的P＜0.05，得到響應值（Y1）CMCase酶活的回歸方程為：Y1=8 792.935+ 971.895 6X1+1180.741X2+863.428 9X3-2 166.05X1X1-1 048.935X1X3-2 397.818X2X2-2 818.473X3X3。

表3 CMCase的ANOVA分析結果Table3 Results of ANOVA for the activity of CMCase

回歸方程中，變量的正系數表明該變量的正向增大可以引起響應值的增大；負的二次項系數表明回歸方程的曲面的開口方向向下，具有極大值點，能夠進行最優分析。在Y1模型中F值為20.707 65，P= 0.001 924＜0.05，說明此模型顯著。由回歸方程可以看出，3個因素對響應值的影響不是簡單的線性關系。由表4可以看出，依據F值可知，3個因素對Y1值的影響為X2＞X1＞X3；模型的失擬性檢驗擬P=0.327 152＞0.05，失擬項不顯著，說明此模型的回歸方程對實驗擬合較好，模型能準確地模擬個因素對CMCase的影響；模型的決定系數R2=0.973 9，說明該模型能夠很好的擬合97%的實驗結果。

利用SAS9.1軟件，通過所得的回歸方程模型得到響應面分析圖和等高線圖如圖1～圖3所示。

當固定其中一個因素為0時，響應值會隨著其他兩個因素的增大而增大，當達到某一極大值后，繼續增加，響應值反而下降。說明響應值Y1有極大值，利用SAS9.1軟件，通過回歸方程得出模型的極大值點，即：X1（氮源）=4.05 g，X2（復合碳源）=3.69 g，X3（磷酸鹽）=4.68%，CMCase最大酶活為94.868 8 IU/mL。

2.2 最優條件的驗證試驗

圖1 Y=f（X1，X2）響應面分析圖和等高線圖Fig.1 Surface plot and contour plot of Y1 between X1and X2

圖2 Y=f（X1，X3）響應面分析圖與等高線圖Fig.2 Surface plot and contour plot of Y1 betweenX1and X3

圖3 Y=f（X2，X3）響應面分析圖與等高線圖Fig.3 Surface plot and contour plot of Y1 between X2and X3

按照理論最優的外部產酶條件，做3次平行試驗，后取平均值得到酶活為92.483 IU/mL與理論值相差不大，說明該模型能較好的擬合97%的實際實驗數據。

3 結論

由本實驗可以得出響應面分析所選取的3個因素：復合碳源，氮源，磷酸鹽對整個發酵產酶過程影響顯著，為不可缺少的條件。并且復合碳源對整個發酵產酶影響最大，蛋白胨次之，最后為磷酸鹽。通過SAS9.1軟件得出本菌株的最優發酵產酶條件為：X1（氮源）=4.05g，X2（復合碳源）=3.69g，X3（磷酸鹽）= 4.68%，CMCase最大酶活為94.868 8 IU/mL。

4 討論

從整個優化實驗結果可以看出，復合碳源對發酵產酶的影響最大，這也驗證了大多試驗的試驗結果：對于產纖維素酶的菌株，碳源不僅僅作為碳源，更是很好的誘導劑，可以促進纖維素酶的產生。本實驗中磷酸鹽也對發酵產酶有顯著影響，這與一般的微生物代謝教科書中的適量的磷酸鹽可以通過促進菌體的生長從而促進酶量的增加[10]。

[1]張加春,易琴,黃遵錫.纖維素酶曲的淺盤生產研究[J].云南師范大學學報：自然科學版,2002(2)：50-52

[2]Charin T N,NaiyatatP N.Thermos Table and alkaline-tolerant microbial cellulase-free xylanases produced from agricultural wastes and the properties required for use in pulp bleaching bioproeesses review[J].Proeess biochemistry,2003,38：1327-1340

[3]Rajesh K,Bund,Rekha S.An alkais Table cellulase by chemical modification using maleic anhydride[J].Carbohydrate Polymers,2002,47：137-141

[4]肖舸,雷芳,喻東,等.一株產纖維素酶綠色木霉的篩選及發酵條件優化[J].四川大學學報,2004(41)：422-425

[5]陳偉紅.誘變處理篩選纖維素酶高產菌株以及發酵條件優化[D].陜西：西北農林科技大學,2007：49-65

[6]佟勇.產纖維素酶放線菌及其酶學性質[D].中國科學技術大學, 2004：6

[7]徐昶,龍敏南,鄔小兵,等.纖維素酶菌株的篩選及產酶條件研究[J].廈門大學學報：自然科學版,2005,29(1)：107-111

[8]Carpenter S.Waterloo region green home[J].A SHRA E Journal, 1996,38(10)：43-46

[9]TKG HOSE.Measurement of cellulase activity[J].Pure&Appl Chem, 1987,59(2)：257-268

[10]楊汝德.現代工業微生物學[M].廣州：華南理工大學出版社,2001：352-356

Optimization of Fermentation Conditions for Cellulase Production of Actinomycetees by Response Surface Analysis

ZENG Bai-quan，XU Zhi，ZHANG Yang-yang
（College of Life of Science and Technology，Central South University of Forestry and Technology，Changsha 410004，Hunan，China）

Study fermentation conditions，an excellent cellulase-producing strain，which was screened by UV and60Co-γray was researched.The ranges of mixture carbon，peptone，KH2PO4were confirmed through single factor experiment.Carbon and Nitrogen sources and KH2PO4were analysised in response surface by using of SAS9.1 software.The results showed that mixture carbon 3.69 g，Nitrogen 4.05 g，KH2PO44.68%，the max cellulase activity was 94.868 8 IU/mL.

Actinomycetees；cellulase；response surface

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.16.026

2013-04-10

湖南省科技計劃項目（2012NK3113）

曾柏全（1967—），男（漢），副教授，博士，主要從事生物活性物質及分子技術與資源研究。